Diagnostik - Wie schnell ist sie heute?

  • Abb. 1: Biomax, Ausgabe 19, 2009. Die Bewegung von Geldnoten in den USA. Jede Linie symbolisiert die geographische Reise einer einzelnen Geldnote zwischen Anfangsort (Seattle: blau, New York: gelb) und verschiedenen Zielorten. Die Physiker analysierten Daten eines amerikanischen Bill. Tracking-Internetspiels © Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbstorganisation, Prof. Dirk BrockmannAbb. 1: Biomax, Ausgabe 19, 2009. Die Bewegung von Geldnoten in den USA. Jede Linie symbolisiert die geographische Reise einer einzelnen Geldnote zwischen Anfangsort (Seattle: blau, New York: gelb) und verschiedenen Zielorten. Die Physiker analysierten Daten eines amerikanischen Bill. Tracking-Internetspiels © Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbstorganisation, Prof. Dirk Brockmann
  • Abb. 1: Biomax, Ausgabe 19, 2009. Die Bewegung von Geldnoten in den USA. Jede Linie symbolisiert die geographische Reise einer einzelnen Geldnote zwischen Anfangsort (Seattle: blau, New York: gelb) und verschiedenen Zielorten. Die Physiker analysierten Daten eines amerikanischen Bill. Tracking-Internetspiels © Max-Planck-Institut für Dynamik und Selbstorganisation, Prof. Dirk Brockmann
  • Abb. 2: Die molekulare Diagnostik macht verborgene Keime sichtbar.

Die molekulare Diagnostik bietet eine schnelle und effiziente Methode um krankmachende von harmlosen Mikroorganismen zu unterscheiden.

Durch die Ausbreitung von neuen, lebendbedrohlichen Infektionen kann heutzutage die ganze Welt aus dem Gleichgewicht geraten. Die kritischen Punkte für die Ausbreitung von Seuchen sind weitgehend durch unsere globale Vernetzung gesteuert. Erst kürzlich wurden gefährliche Erreger, wie das Norovirus und das EHEC-Bakterium, die über Nahrungsmittel verbreitet wurden, als Epidemieverursacher diagnostiziert.

Wenn eine neue ansteckende Krankheit für den Menschen aufkommt, dann kann heutzutage die ganze Welt aus dem Gleichgewicht geraten. So hat die Ausbreitung des SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) Virus-Erregers, der beim Menschen eine lebendsbedrohliche Lungenerkrankung verursacht, im Jahr 2003 gezeigt, dass nicht nur das tödliche Potential des Erregers, sondern auch unsere globale Vernetzung erheblich zur Ausbreitung einer weltweiten Epidemie beitragen kann [1].

Für die Ausbreitung von neuen, ansteckenden Krankheiten haben Wissenschaftler ein Computermodell entwickelt und gezeigt, dass Viren und andere gefährliche Erreger sich global und vorrangig durch den Flugreiseverkehr ausbreiten [2]. Wie genau sich solche gefährlichen Keime um die Welt verteilen und wo die besonders kritischen Punkte für deren Ausbreitung liegen, überlappt mit dem modernen Reiseverhalten der Menschen.

Die am häufigsten angeflogenen, großen und attraktiven Städte, wie Frankfurt, New York und Tokio, sind zu den wichtigsten Knotenpunkten für den Flugverkehr geworden und können somit erheblich zur weltweiten Ausbreitungen von ansteckenden Krankheiten beitragen. So ist auch für diese Städte die Bedrohung weitaus grösser als für ein kleines, naheliegendes Dorf. Das haben auch Göttinger Wissenschaftler in ihrem mathematischen Modell aufgezeigt [2]. Ein Notfallplan zur Schließung der wichtigsten Knotenpunkte in der Welt, ist daher längst entworfen.

Auf den Spuren des Geldes
Die Gesetzmäßigkeiten menschlichen Reiseverhaltens analysierten die Göttinger Wissenschaftler sehr genau, indem sie den Spuren des Geldes folgten.

Durch die Weitergabe von markierten Dollarnoten, die durch Reisende in den USA von Ort zu Ort befördert wurden, wurden in einem sogenannte amerikanischen Bill- Tracking Internetspiel alle Daten gesammelt um genaue Rückschlüsse auf die statistischen Eigenschaften des Reiseverhaltens zu ziehen [2].

Für andere ansteckende Infektionskrankheiten, wie die jährlich wiederkehrende Influenzawelle im Spätherbst, ist eine Seuchenbekämpfung außerordentlich gut gelungen [1]. Damit die Vermehrung der Viren effektiv gebremst wird, werden die alljährlich neu entwickelten Impfstoffe den neu auftretenden Influenzavirusvarianten weitgehend angepaßt.

Aber genau so gefährlich und häufig auftretend sind Seuchen, die akut über Nahrungsmittel hervorgerufen werden. Dass für den Mensch bestimmte Bakterien und Viren, die über Nahrungsmittel verbreitet werden, auch krankmachend und lebendbedrohlich sein können, hat sich in den letzten Jahren häufiger gezeigt.

Erreger in Lebensmitteln
Noroviren: Verursacher von lebendbedrohlichen Infektionen

Gefährliche Keime, die über Nahrungsmittel die Gesundheit des Menschen bedrohen, zeigten sich im Jahr 2012, als 70 Passagiere auf einem Kreuzfahrtschiff plötzlich von Übelkeit und Erbrechen heimgesucht wurden. Für die akut infizierten Passagiere musste schnell eine Diagnose geliefert werden um den Erreger zu bestimmen, um die akuten Symptome zu bekämpften und die Menschen aus der Quarantäne zu befreien [3]. In diesem Fall wurde das Norovirus als Verursacher diagnostiziert. Das Virus wurde über Lebensmittel übertragen und ist nun als Kreuzfahrervirus bekannt. Das hier gefundene Norovirus war auch verantwortlich für die bisher größte lebendsmittelbedingten Magen- Darm-Grippewellen. An etlichen ostdeutschen Kindertagesstätten und Schulen erkrankten insgesamt 11.000 Kinder an Durchfall und Erbrechen. Die vermutliche Infektionsquelle dafür waren tiefgekühlte Erdbeeren aus Ostasien, die über ein Catering-Unternehmen geliefert wurden [3].

Darmbakterien und ihre gefährlichen Varianten
Für ähnliche Symptome, wie die starke Magen-Darmgrippe und Brechdurchfall, sorgten nicht nur Viren, sondern auch gefährliche Bakterien wie das enterohämorrhagische Escherichia coli Bakterium (EHEC). Im Sommer 2011 zeigte sich, dass die EHEC-Bakterien verantwortlich sind für das haemolytische-uraemische Syndrom und die HUS-Epidemie oder auch EHEC-Epidemie genannt. Die über Lebensmittel übertragenen Bakterien und deren Toxine wirken schädigend auf Blutgefäße und Blutzellen und können sogar die Nierenfunktion zerstören [4].

Die Behörden für Lebensmittelsicherheit veröffentlichten im Juni 2011, dass für die EHEC-Epidemie vermutlich Sprossengemüse als Überträger der Bakterien gelte. Die erste Warnung, dass die Gemüsesorten, Salat, Gurken und Tomaten kontaminiert sein sollten, wurde aufgehoben. Später ergaben sich durch weitere Analysen, dass mit großer Wahrscheinlichkeit die ökologischen Bockshornkleesamen, die aus Ägypten nach Deutschland importiert wurden, dafür verantwortlich waren [4]. Die Epidemie wurde Ende Juni 2011 vom Robert Koch- Institut für beendet erklärt. In Deutschland erkrankten insgesamt 855 Menschen an HUS und 53 Menschen starben an der Infektion.

Den Nachweis von solchen gefährlichen Viren, Bakterien und Pilzen in Nahrungsmitteln oder in Stuhlproben von Menschen oder auch in anderen Probenmaterialien ist somit grundlegend und unabdingbar. Die Diagnostik muss jedenfalls schnell durchgeführt werden, um die richtige Therapie zügig einleiten zu können.

Harmlose oder krankmachende Mikroorganismen
Mikroorgansimen, dazu zählen die prokaryotischen Bakterien, sowie eukaryotische Pilze und Hefen, sind in der Luft, auf unserer Haut, im Boden und im Wasser zu finden. In unser gesunden Darmflora befindet sich der Bakterienstamm Escherischia coli. E. coli ist einer unserer unverzichtbaren Helfer, der notwendig ist um unsere Nahrungsprodukte zu zerkleinern. Die gesunden Keimdichte beim Menschen im Darm beträgt 1010 / g. Im Mund (Speichel) beträgt die Keimdichte 108 / ml. Wenn es um alle pathogenen und nichtpathogenen Organismen geht, zählen auch die Viren darunter, obwohl Sie als nichtzelluläre Partikel nicht zu den Mikroorganismen zu rechnen sind. Es ist bekannt, dass Bakterien und sogar viele andere Organismen, wie Pilze, als wichtige Helfer im Boden tätig sind. Sie sorgen für die Umsetzung von Substraten, die dann wiederum weiter als Nahrungsprodukte für Pflanzen dienen.

Viele der krankmachenden Bakterienstämme stammen von harmlosen Bakterien ab und haben neue pathogene Eigenschaften erlangt. Sie haben die Fähigkeit, ein besonderes Hüllprotein auszubilden oder besitzen die Eigenschaft zur Herstellung von gefährlichen Toxinen. So sind die EHEC Bakterien nahe Verwandte der harmlosen E. coli Bakterienstämme [5]. Doch wie kann nun zwischen den oft so nützlichen und harmlosen Viren, Bakterien, oder auch Pilzen, und den krankmachenden Keimen so schnell unterschieden werden? Mit welchen Methoden und welchen Diagnostiken ist es möglich, den Unterschied zu sehen?

Verborgene Keime werden sichtbar mit molekularer Diagnostik
Die schnellste und effizienteste Methode, die heutzutage zum Nachweis von krankmachenden Erregern eingesetzt wird, ist die quantitative Real-Time (Echtzeit) PCR [6]. Die qPCR ist eine Weiterentwicklung der klassischen PCR-Methode (Polymerase- Chain Reaction).

Gezielt können Teilabschnitte spezifischer Nukleinsäuresequenzen, DNAoder RNA, von Organismen mit der Hilfe von Starterfragmente, sogenannten Oligonukleotiden oder Primern, nachgewiesen werden. Die Technik basiert auf einer exponentiellen Vervielfältigung (Amplifikation) von Ziel-DNA mit Hilfe der thermostabilen Thermus aquaticus (Taq)- Polymerase oder anderen hitzestabilen Enzymen. Die DNA oder RNA wird vorerst aus dem Probenmaterial isoliert. Wenn RNA-Viren, wie z.B. Noroviren im Probenmaterial aufgesucht werden müssen, dann wird die RNA durch eine enzymatische Vorbehandlung, eine sogenannte „Reverse Transkription“, in DNA Moleküle umgeschrieben.

Für die anschließende Real-Time PCR, wird bei der einfachsten Variante während der Amplifikation fluoreszierende Fabstoffmoleküle wie z. B. SYBR-Green in die DNA in die neusynthetisierten Doppelstang-DNA eingelagert. Durch den Einsatz dieser fluoreszierenden Moleküle kann die Amplifikationsreaktion in Echtzeit (Real- Time) mitverfolgt und quantifiziert werden. Aufgrund der exponentiellen Vermehrung der Ausgangs- DNA (Template) nimmt mit der ansteigenden Anzahl der PCR-Produkte auch die Menge an Fluoreszenzsignalen zu. So verhält sich das Fluoreszenzsignal proportional zur Amplifikationsmenge [6].

Expertise zur Pathogendiagnostik Die Sequenzierprojekte haben zu einem erheblichen Erkenntniszuwachs hinsichtlich der Klassifikation von Mikroorganismen und ihrer Verwandtschaftsverhältnisse geführt. Biobioseminars hat für die Unterscheidung von naheverwandten Mikroorganismen, ein intelligentes Primer- Design entwickelt [7]. Um auch naheverwandte Spezies auf der DNA-Ebene nachzuweisen bzw. auch voneinander zu unterscheiden, werden als Stütze in die Startersequenzen modifizierte Nukleotidbausteine, sogenannt LNAs (engl. Locked nucelotid acid) mit eingebaut. Diese mit LNAs angefüllten Primer bieten den Vorteil, dass die Zielspezifität erhöht wird und Familien, Gattungen und Arten von Pathogenen besser miteinander verglichen werden können. Aufgrund Ihrer chemischen Eigenschaften erhöhen diese Primer die thermische Stabilität für in vitro-Anwendungen.

Literatur
[1] Weltgesundheitsorgansiation WHO. URL: http://www.who.int/ csr/sars/en/index.html
[2] Brockmann D. et al.: Nature 439:462-465 (2006)
[3] Bundesinstitut für Risikobewertung (2012). Online as viewed on 06.10.2012. URL: http://www.bfr. bund.de/cm/343/tenazitaet-widerstandsfaehigkeit- von-noroviren- in-erdbeerkompott.pdf
[4] Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) (2012). Online as viewed on 18.01.2014. URL: http://www. efsa.europa.eu/en/supporting/ doc/176e.pdf.
[5] Weltgesundheitsorgansiation: Online as viewed on 18.01.2014. URL: http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs125/en/index. html.
[6] Overbergh L. et al.: Molecular Diagnostics Elsevier Inc., 87-105 (2010)
[7] Biobioseminars. Online as viewed on 20 01 2014. http://www. biobioseminars.com/

Weitere Literatur ist direkt bei den Autoren erhältlich.

Kontakt
Dr. Jutta Wirth
Biobioseminars Universität Wageningen
Niederlande
jutta.wirth@wur.nl

Autor(en)

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Wageningen University
Zodiac: Bldg. 122 Room B0016
6700 AH Wageningen
Telefon: +31 (0) 317 48 48 48

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