DNA-Microarrays in der Diagnostik

Resistenzprofil des gram-negativen Bakteriums Acinetobacter baumannii

  • Abb. 1: Zeitbedarf der einzelnen Arbeitsschritte der Microarray-Analyse im Vergleich zur kulturbasierten Sensitivitätstestung. Während das Resultat des molekularbiologischen Nachweises bereits 4 h nach der Probennahme am Patienten vorliegen kann, benötigt die phänotypische Charakterisierung eines Erregers etwa 2 Tage.Abb. 1: Zeitbedarf der einzelnen Arbeitsschritte der Microarray-Analyse im Vergleich zur kulturbasierten Sensitivitätstestung. Während das Resultat des molekularbiologischen Nachweises bereits 4 h nach der Probennahme am Patienten vorliegen kann, benötigt die phänotypische Charakterisierung eines Erregers etwa 2 Tage.
  • Abb. 1: Zeitbedarf der einzelnen Arbeitsschritte der Microarray-Analyse im Vergleich zur kulturbasierten Sensitivitätstestung. Während das Resultat des molekularbiologischen Nachweises bereits 4 h nach der Probennahme am Patienten vorliegen kann, benötigt die phänotypische Charakterisierung eines Erregers etwa 2 Tage.
  • Abb. 2: Ausschnitt eines Microarrays im Fluoreszenzscanner zur Detektion von Resistenzgenen eines klinischen Acinetobacter baumannii Isolats (links). Das Sondenmuster deutet auf die Anwesenheit 28 verschiedener Resistenzgene hin (rechts), was die Anzahl noch wirksamer antibiotischer Substanzen empfindlich einschränkt. Anhand der Microarrayanalyse können diese Antibiotika identifiziert und zur Therapie des betroffenen Patienten eingesetzt werden.

Microarrays ermöglichen durch spezifische Basenpaarung von Nukleinsäuren die Charakterisierung komplexer Nukleinsäuregemische. Ihre Anwendung reicht von der genomweiten Analyse bis hin zur Detektion von Einzelpolymorphismen. In der Abteilung Molekulare Biotechnologie des Fraunhofer- Instituts für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB werden Microarrays insbesondere zum Einsatz in der Infektionsdiagnostik entwickelt. Dabei entstehen diagnostische Werkzeuge, welche mittels hochgradig paralleler Nukleinsäureanalytik eine sehr schnelle sequenzbasierte Typisierung, Identifizierung und Charakterisierung infektiöser Bakterien und Pilze ermöglichen.

In den letzten Jahren trat das Bakterium Acinetobacter baumannii, welches lokale Infektionen, aber auch Lungenentzündungen oder Blutvergiftungen verursachen kann, insbesondere auf Intensivstationen vermehrt auf. Besorgniserregend ist A. baumannii insbesondere durch seine Eigenart, gleichzeitig zahlreiche Resistenzfaktoren in sich aufzunehmen und so gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent zu werden. In Zusammenarbeit mit dem Herz- und Diabeteszentrum NRW ist es nun am IGB gelungen, einen Microarray zu entwickeln, der 98 Resistenzgene des Bakteriums detektieren und damit innerhalb weniger Stunden ein Resistenzprofil eines Stammes erstellen kann. Dieses neue diagnostische Werkzeug ermöglicht eine rasche und zielgerichtete antibiotische Behandlung kritisch erkrankter Patienten und beeinflusst damit maßgeblich den Ausgang schwerer bakterieller Infektionen.

Entwicklung der Microarray-Technologie
Die DNA-Microarray-Technologie wurde seit ihrer erstmaligen Anwendung in den 1990er Jahren für vielfältige Forschungszwecke eingesetzt. Hierzu zählen komparative Transkriptomstudien, die Charakterisierung von Genomen, die Detektion von Einzelnukleotid- Polymorphismen, die Analyse mikrobieller Populationen wie auch die Genotypisierung. DNA-Microarrays bestehen aus verschiedenen, in ihrer Sequenz definierten DNA-Molekülen (Sonden), welche auf einer planaren Oberfläche räumlich aufgelöst immobilisiert werden.

Wird der Microarray mit der zu analysierenden Proben-DNA (Analyt) überschichtet, hybridisiert diese sequenzabhängig und der spezifischen Basenpaarung folgend mit verschiedenen Sonden. Dies ist die Basis der Analyse von Nukleinsäuregemischen komplexer Zusammensetzung. Die Markierung der zu analysierenden Nukleinsäuren, beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen, gestattet es, die spezifische DNA-Interaktion zwischen Analyt und den spezifischen Sonden des Microarrays nachzuvollziehen. Aus dieser Interaktion können Rückschlüsse auf die Zusammensetzung und Identität des vorliegenden Nukleinsäuregemischs gezogen werden. In dieser Funktion als Werkzeug zur Nukleinsäureanalytik haben sich DNA-Microarrays in den letzten Jahrzehnten etabliert und bewährt.

Aktuell eingesetzte DNA-Microarrays zeichnen sich durch kosteneffiziente und einfache Handhabung aus und sind insbesondere durch die Möglichkeit, Tausende von Sonden zu immobilisieren, in der Lage, eine hochgradig parallele Nukleinsäureanalytik zu ermöglichen. Die Kombination von Microarray-Technologie mit PCR-Verfahren gestattet sensitive Detektionsprozesse unter Analyse einer Vielzahl von Parametern. Vor diesem Hintergrund zeigen DNA-Microarrays großes Potential für den Einsatz bei infektionsdiagnostischen Fragestellungen, die eine leistungsfähige und zugleich kosteneffiziente Analytik erfordern. Insbesondere kleinen klinischen Einrichtungen ohne Anschluss an eine zentrale Labordiagnostik kann der Einsatz der DNA-Microarray-Technologie Zugang zu schnellen und spezifischen Diagnostika für infektionsmedizinische Indikationen geben.

Entwurf eines Resistenz-Microarrays
In der Abteilung Molekulare Biotechnologie des IGB werden neue Microarrays für verschiedene Anwendungen im medizinischen Bereich entwickelt. So wurden beispielsweise analytische Arrays zur Charakterisierung von Tumorgewebe etabliert. Der Schwerpunkt der Entwicklungsarbeit liegt jedoch auf Microarrays, die in der Infektionsdiagnostik eingesetzt werden. Hierzu zählen Arrays zur Typisierung, Identifizierung und Charakterisierung von infektiösen Bakterien und Pilzen. Die Typisierung dient der Aufklärung von Übertragungswegen und Infektionsketten eines Erregers und ermöglicht somit beispielsweise eine Anpassung der Hygienemaßnahmen in Kliniken. Die Identifizierung des auslösenden Keims einer Infektion liefert wichtige Hinweise, wie dieser adäquat zu bekämpfen ist. Vielerorts kommen zur Identifizierung von Krankheitserregern konventionelle, kulturbasierte Verfahren zum Einsatz, die kostengünstig, aber auch zeitintensiv sind. Durch den Einsatz von Microarrays können Erreger direkt aus einer Patientenprobe binnen weniger Stunden nachgewiesen werden (Abb. 1). Die Charakterisierung eines bakteriellen Erregers mittels Microarray kann Aufschluss über seine Pathogenität geben, etwa ob der Stamm dazu in der Lage ist, Toxine zu bilden. Von größter Relevanz für die erfolgreiche Behandlung eines bakteriellen Krankheitserregers ist die Charakterisierung im Hinblick auf evtl. vorliegende Antibiotikaresistenzen. Die zunehmende Ausbreitung der verschiedensten Resistenzen, von denen alle bekannten Antibiotika-Wirkstoffklassen betroffen sind, hat in den letzten Jahren zu einem Anstieg der mit bakteriellen Infektionskrankheiten assoziierten Sterblichkeit geführt. Allerdings verfügt jede bakterielle Spezies über ein eigenes Repertoire an Resistenzgenen, was die Entwicklung eines Microarrays, der alle existierenden bakteriellen Resistenzdeterminanten gleichzeitig detektiert, unmöglich macht. Durchaus möglich ist es allerdings, einen Resistenz- Microarray für einzelne klinisch relevante Spezies zu entwerfen.

So wurde beispielsweise in Zusammenarbeit mit dem Herzund Diabeteszentrum NRW am IGB ein Microarray entwickelt, um 98 Resistenzgene des Bakteriums Acinetobacter baumannii zu detektieren. Diese Spezies kann Auslöser von lokalen Infektionen bis hin zur Lungenentzündung oder Blutvergiftung sein und tritt gehäuft auf Intensivstationen auf, wo sie nicht selten stationsweite Ausbrüche verursacht. Berüchtigt ist A. baumannii insbesondere für die Vielzahl verschiedener Resistenzfaktoren, die die Spezies in sich vereinigen kann. So wurden bereits mehrfach Isolate beschrieben, die sich als resistent gegenüber allen getesteten Antibiotika zeigten. Mit Hilfe des Microarrays ist es möglich, innerhalb von 4 Stunden ein Resistenzprofil des jeweils vorliegenden Stammes zu erstellen, das die noch verbleibenden therapeutischen Optionen aufzeigt (Abb. 2). Dies ermöglicht eine rasche und zielgerichtete antibiotische Behandlung kritisch erkrankter Patienten. Die rechtzeitige Verabreichung eines auf den Erreger abgestimmten Antibiotikums beeinflusst maßgeblich den Ausgang schwerer bakterieller Infektionen.

Hinsichtlich der raschen Erregeridentifizierung konkurriert die Microarray-Technologie mit anderen molekularbiologischen Methoden wie z. B. der Massenspektrometrie. Zur Anwendung dieser muss der zu identifizierende Keim allerdings in ausreichender Konzentration in Reinkultur vorliegen, was die direkte Analyse von Patientenproben in den meisten Fällen ausschließt. Hinsichtlich der schnellen molekularbiologischen Detektion von Pathogenitätsfaktoren und Resistenzgenen ist die Arraytechnologie jedoch ohne Alternativen.

Ausblick
Um den vergleichsweise hohen Aufwand an personellen Ressourcen, der mit dem Einsatz von Microarrays verbunden ist, zu reduzieren, wurden in den letzten Jahren vollständig automatisierte Verfahren entwickelt. In diesen sogenannten lab-on-a-chip (LOC) Systemen werden alle Arbeitsschritte maschinell innerhalb einer einmalig nutzbaren Kartusche durchgeführt. Obgleich die Materialkosten durch diese Vorgehensweise weiter ansteigen, erlaubt die Automatisierung eine bequeme Integration der Microarray-Technologie in die Routinediagnostik von Krankenhäusern.

Kontakt
PD Dr. Susanne M. Bailer
Fraunhofer Institut für Grenzflächenund Bioverfahrenstechnik (IGB)
Stuttgart
Tel.: 0711/970-4180
susanne.bailer@igb.fraunhofer.de

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/GIT-Microarray
Neuartige Lab-on-a-chip Analysensysteme: http://bit.ly/Vor-Ort-Diagnostik

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Telefon: +49 711 9704 001
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