Intravitalmikroskopische Untersuchungen

Visualisierung der inflammatorisch induzierten Gefäßpermeabilität in vivo

  • Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). A: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min in einer Kontroll-Gruppe.Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). A: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min in einer Kontroll-Gruppe.
  • Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). A: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min in einer Kontroll-Gruppe.
  • Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). B: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min in einer Kontroll-Gruppe.
  • Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). C: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min Endotoxinämie mit Lipopolysacchariden.
  • Abb. 1: Zur Quantifizierung der Plasmaextravasation erfolgte i.v.-Applikation von flluoreszenzmarkiertem Albumin 10 min vor der ersten intravitalmikroskopischen Messung (IVM). D: postkapilläre Venole; IVM bei 0 min und nach 120 min Endotoxinämie mit Lipopolysacchariden.

Die Intravitalmikroskopie umfasst eine Vielzahl mikroskopischer Untersuchungstechniken mit denen es möglich ist, quantitative, qualitative und dynamische Erkenntnisse über zellbiologische Prozesse an lebenden Organismen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu gewinnen. In diesem Beitrag soll ein kurzer Überblick über ausgewählte Aspekte der Fluoreszenzmikroskopie im Rahmen intravitalmikroskopischer Untersuchungen des inflammationsbedingten Endothelschadens mit gesteigerter Gefäßpermeabilität gegeben werden.

Seit ihrer Erstbeschreibung im 19. Jahrhundert haben sich die intravitalmikroskopischen Untersuchungstechniken kontinuierlich weiterentwickelt und unser Verständnis molekularer und biophysikalischer Prozesse im Rahmen zellulärer Interaktionen wesentlich bereichert. Durch die Entwicklung mikroskopischer Techniken mit Eindringtiefen bis zu 1000 µm und der Möglichkeit der Visualisierung struktureller Unterschiede zwischen höher und tieferliegenden Gewebeschichten, hat der Erkenntnisgewinn aus intravitalmikroskopischen Untersuchungsmethoden in der Neurobiologie, Immunologie und Tumorbiologie in den letzten dreißig Jahren eine beeindruckende Dynamik bekommen, die bereits in mehreren ausführlichen Übersichtsartikeln detailliert dargestellt wurde [1-6]. Die Kombination mikroskopischer Techniken wie der Fluoreszenzmikroskopie oder der Multiphotonenmikroskopie mit pharmakologischen und genetischen Untersuchungsmethoden erlaubt es heute, Ergebnisse und Konzepte aus in vitro Studien in vivo kritisch zu überprüfen und weiterzuentwickeln.

Die Intravitalmikroskopie
Zur Beurteilung der mikrovaskulären Gefäßpermeabilität ist die Intravitalmikroskopie besonders geeignet, da sie eine zeitliche und räumliche Quantifizierung von Permeabilitätsänderungen im untersuchten Gefäßsystem mit einem Auflösungsvermögen von bis zu 1 μm ermöglicht. Durch die Erhebung hämodynamischer und serologischer Parameter in Kombination mit mikroskopischen Untersuchungen erhält man ein detailliertes Bild über den makrovaskulären und mikrovaskulären Status von Versuchstieren und kann differenzierte Aussagen über die Effekte pharmakologischer Wirkstoffe treffen.

Um die zu untersuchenden Zielstrukturen der Intravitalmikroskopie zugänglich zu machen, erfolgt ein möglichst atraumatischer und für das Versuchsmodell spezifischer mikrochirurgischer Eingriff an anästhesierten Versuchstieren. Für die Versuchsqualität und Stabilität ist es anschließend wichtig, ein möglichst physiologisches Milieu (Temperatur, pH, Flüssigkeitssuperfusion) für das zu untersuchenden Gewebe aufrechtzuerhalten. Strategien zur Minimierung phototoxischer Effekte der Fluoreszenzmikroskopie beinhalten eine sorgfältige Auswahl der fluoreszierenden Substanzen, der Lichtintensität- und Wellenlänge, der Belichtungszeit, sowie die Verwendung hochsensibler Kameratechnik mit einem hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögen [7].

Die Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenzmikroskopie ist eine Variante der Lichtmikroskopie, die auf dem physikalischen Prinzip der Fluoreszenz beruht. Dabei wird die Eigenschaft bestimmter fluoreszenter Stoffe (Fluorochrome) ausgenutzt, Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren und mit veränderter Wellenlänge wieder zu emittieren. Das Anregungs- und Emissionslicht kann durch Verwendung spezieller optischer Filter des Mikroskops im selben Strahlengang optisch getrennt werden. Die meisten zur Intravitalmikroskopie verwendeten Fluoreszenzmikroskope entsprechen in ihrem Aufbau Auflichtmikroskopen mit Quecksilberdampflampen oder Lasern als Lichtquellen, wobei das untersuchte Objekt nicht durchstrahlt sondern durch das Objektiv beleuchtet wird, weshalb korrekterweise von Epifluoreszenzmikroskopie gesprochen wird. Einige endogene Proteine sind autofluoreszent und können direkt mikroskopisch untersucht werden [8]. Wesentlich häufiger wird ein spezifischer Fluoreszenzfarbstoff zur selektiven Darstellung von Zielstrukturen appliziert, wodurch diese mit hohem Kontrast dargestellt werden können. Intravitalmikroskopische Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind aus physikalischen und bildauflösungstechnischen Gründen auf eine Eindringtiefe von 50 µm limitiert. Liegt das zu beobachtende Gewebe mehr als 50 μm unter der Organoberfläche, sollte die Multiphotonenmikroskopie als das Verfahren mit der deutlich höheren Gewebeeindringtiefe verwendet werden [9, 10]. Eine intravital durchgeführte Multiphotonenmikroskopie mit entsprechender Aufarbeitung der Bilddaten kann dann zum Beispiel die 3-D Analyse der Zellmigration in lebendem Gewebe ermöglichen [11].

Anwendung der Mikroskopietechniken
Die Fluoreszenzintravitalmikroskopie wird seit den 1970er Jahren zur Untersuchung der durch einen Endothelschaden bedingten Gefäßpermeabilität in unterschiedlichen Inflammationsmodellen verwendet. Endothelzellen sind die zum Gefäßlumen gerichteten Zellen der innersten Wandschicht von Blutgefäßen und gehören zu den ersten Zellen des Organismus, die mit zirkulierenden Pathogenen in Kontakt kommen. Durch inflammatorische Stimuli aktivierte Endothelzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Initiierung, Aufrechterhaltung und Limitierung der Wirtsreaktion auf die Invasion pathogener Mikroorganismen [12]. Eine inflammationsinduzierte Endotheldysfunktion bewirkt eine gesteigerte Gefäßpermeabilität mit Austritt von intravasaler Flüssigkeit in das Interstitium, eine gesteigerte Leukozyten-Endothel-Interaktion sowie eine dysregulierte Aktivierung des Gerinnungssystems mit konsekutiver schwerwiegender Mikrozirkulationsstörung - einem fundamentalen Charakteristikum der Sepsis [13-15].

Die Sepsis ist eine komplexe systemische Entzündungsreaktion des Organismus auf eine Infektion und ist mit einer hohen Mortalität, weltweit steigenden Inzidenzen und immensen gesundheitsökonomischen Belastungen assoziiert [16, 17]. Die genannte Entwicklung eines Endothelschadens mit gesteigerter Gefäßpermeabilität ist eines der frühesten Anzeichen einer strukturellen Organschädigung in der Sepsispathogenese und kann durch intravitalmikroskopische Untersuchungen quantifiziert werden [18, 19]. Um diesen pathophysiologischen Vorgang zu visualisieren, werden fluoreszenz-markierte Proteine wie Albumin mit einer Molekulargröße zwischen 70 und 150 kD intravenös appliziert, die bei einer physiologisch intakten Gefäßendothelbarriere intravasal bleiben, aber unter Entzündungsbedingungen und dem Vorliegen einer Endotheldysfunktion mit Endothelschaden ins umliegende Interstitium gelangen. Ein etabliertes tierexperimentelles Modell für die Untersuchung des sepsis-assoziierten Endothelschadens ist die Induktion einer Endotoxinämie mit Lipopolysacchariden gram-negativer Bakterien bei Ratten [19]. Der entstehende Endothelschaden kann hierbei an postkapillären mesenterialen Venolen anhand der Intensitätszunahme des Signals von fluoreszenz-markiertem Albumin im Interstitium in Relation zum intravasalen Signal intravitalmikroskopisch ermittelt werden (s. Abb. 1).

Ausblick in die Zukunft
Die klinische Therapie der humanen Sepsis ist trotz der Möglichkeiten moderner Intensivmedizin und jahrzehntelanger Forschungsbemühungen auf symptomatisch orientierte Ansätze limitiert. Besonders der sepsisinduzierte Endothelschaden ist klinisch als auch experimentell evidenter Ansatzpunkt der Therapie. Dabei stellt das Gefäßendothel eine attraktive Zielstruktur für anti-inflammatorische Wirkstoffe dar [20]. Hier bieten intravitalmikroskopische Untersuchungen die Möglichkeit therapeutisch wirksame Substanzen für die zukünftige klinische Sepsistherapie zu identifizieren.

Literatur
[1] Weigert R. et al..: Histochem Cell Biol, 133(5):481-491
[2] Gavins FN: Curr Opin Pharmacol, 12(5):601-607
[3] Amornphimoltham P. et al.: Adv Drug Deliv Rev, 63(1-2):119-128.
[4] Matheson PJ, Garrison RN: Microsurgery 25(4):247-257 (2005)
[5] Mempel TR. et al.: Curr Opin Immunol, 16(4):406-417 (2004)
[6] Menger MD. et al.: Ann Acad Med Singapore, 28(4):542-556 (1999)
[7] Saetzler RK. et al.: J Histochem Cytochem, 45(4):505-513 (1997)
[8] Zipfel WR. et al.: Proc Natl Acad Sci U S A 100(12):7075-7080 (2003)
[9] Oheim M.: J Neurosci Methods, 111(1):29-37 (2001)
[10] Kobat D. et al.: Opt Express, 17(16):13354-13364 (2009)

Weitere Literatur ist bei den Autoren erhältlich.

 

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