Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie - Wie funktioniert die Kontrastgebung?

  • Tornwaldt Zyste in der MRT (FLAIR sagittal). Rote Pfeile: Zyste in der Mittellinie des Nasopharynx und Gdl. pinealis. © HellerhoffTornwaldt Zyste in der MRT (FLAIR sagittal). Rote Pfeile: Zyste in der Mittellinie des Nasopharynx und Gdl. pinealis. © Hellerhoff
  • Tornwaldt Zyste in der MRT (FLAIR sagittal). Rote Pfeile: Zyste in der Mittellinie des Nasopharynx und Gdl. pinealis. © Hellerhoff
  • Abb. 1: Darstellung der 3D-Struktur des Zarvins. In grün und orange sind die Gd3+ -Bindestellen des Proteins dargestellt. In rot die Seitenketten von Aminosäuren der Z-Domäne, welche an einen lgG-Anikörper binden. In blau ist der Dekaglycin-Linker dargestellt.
  • Abb. 2: Fluoreszenzmarkierter Komplex aus dem monoklonalen Antikörper Cetuximab und Zarvin (rot) bindet an den EGF-Rezeptor in der Zellmembran von A431-Zellen.
  • Abb. 3: NMRD-Profil des mit Gd3+ gesättigten Zarvins bei 37 °C. Das Profil zeigt die Abhängigkeit der Effizienz des Kontrastmittels Zarvin: (Gd3+)2 (Relaxivität r1) von der Magnetfeldstärke. Die Effizienz ist besonders hoch bei Feldstärken zwischen 1 und 2 Tesla.

Bei der Diagnostik und Lokalisierung von Tumoren setzen Mediziner in zunehmendem Maße auf die Magnetresonanztomographie (MRT), da diese Technik gegenüber der klassischen Computertomographie geringere Nebenwirkungen aufweist.

Während die Computertomographie mit Röntgenstrahlung arbeitet, basiert die Bildgebung bei der MRT auf dem Verhalten der Protonen von Wassermolekülen im Körper, wenn diese einem äußeren Magnetfeld ausgesetzt werden. Dabei verhalten sich die Protonen wie kleine Magnete, die sich entlang der Feldlinien des Magnetfeldes ausrichten. Diese Anordnung wird während einer Untersuchung durch das Einstrahlen eines Wechselfeldes mit geeignetem Radiofrequenzband aus dem Gleichgewicht gebracht. Die Dauer der Rückkehr in den Gleichgewichtszustand (Relaxationszeit) ist dabei in unterschiedlichen Gewebetypen verschieden lang und kann zur Berechnung eines Kontrastes zwischen den einzelnen Geweben genutzt werden.

Basis der MRT-Kontrastmittel

Sowohl bei der Computertomographie, als auch bei der MRT besteht die Möglichkeit, dem Patienten zusätzliche Kontrastmittel zu injizieren, welche die Sensitivität der jeweiligen Technik verbessern. Anatomische Strukturen, die für ein solches Kontrastmittel zugänglich sind, lassen sich dann gut von ihrer Umgebung abgrenzen. In der MRT-unterstützten Tumordiagnostik eingesetzte Kontrastmittel setzen sich in der Regel aus einem paramagnetischen Gadolinium(III)-Ion und einem chelatierenden Molekül zusammen, welches das ansonsten toxisch wirkende Gd3+ komplexiert. Dabei wird das Gadolinium(III)-Ion durch den Chelator nicht vollständig „umhüllt", sodass noch Wassermoleküle offene Koordinationsstellen des Gd3+ besetzen und in direkten Kontakt mit diesem Ion treten können. Dieser Kontakt verkürzt die Relaxationszeit der Protonen koordinierter Wassermoleküle. Diese Wassermoleküle unterliegen zudem einem ständigen schnellen Austausch, behalten aber über eine kurze Zeit ihr verändertes Relaxationsverhalten bei. Während dieser Zeit diffundieren sie in die Umgebung des Gewebes, wo sie die durchschnittliche Relaxationszeit der Protonen der Wassermoleküle innerhalb dieses größeren Volumenelementes bzw.

Gewebes verkürzen [1]. Dies wiederum führt zu einem erhöhten Kontrast der entsprechenden Gewebe, welche nun im bildgebenden Verfahren gegenüber der Umgebung heller erscheinen.

Neue Kontrastmittel

Klassische MRT-Kontrastmittel enthalten ein niedermolekulares organisches Chelatormolekül. Sie sind jedoch nicht sensitiv genug, um kleine Tumoren oder gar Metastasen bei den gängigen klinisch eingesetzten Feldstärken (0,5 bis 1,5 Tesla) sichtbar zu machen. Sie sind wenig effizient und sammeln sich nicht nur im Tumorgewebe, sondern auch in umliegenden Geweben an, was die Kontrasterhöhung mindert. Aus diesem Grund wird momentan intensiv an der Entwicklung neuartiger und verbesserter Kontrastmittel für die MRT gearbeitet. Um das Kontrastmittel kontrolliert an gewünschte biologische Zielstrukturen wie Tumorzellen zu leiten und damit eine selektive Konzentrierung zu erreichen, kann man die Chelatoren an Zielstruktur-bindende Moleküle koppeln. Darüber hinaus lässt sich aber auch die Kontrastverstärkung auf zweierlei weitere Arten steigern [1]. Zum einen kann man mehrere Kontrastmittelmoleküle zu Nanopartikeln verknüpfen (Assembly-Ansatz). Dadurch erreicht man an Tumorzellen eine sehr hohe lokale Gd3+-Konzentration, hat aber den Nachteil, dass Nanopartikel aufgrund ihrer Größe häufig nur limitiert in der Lage sind, Blutgefäße zu verlassen und extravaskuläre Zielstrukturen zu erreichen. Zudem können Nanopartikel ebenfalls aufgrund ihrer Größe meist nicht mehr über die Nieren ausgeschieden werden, sondern müssen zunächst in der Leber abgebaut werden [2]. Dieser verlängerte Aufenthalt des Kontrastmittels im Patienten kann zu einer erhöhten Freisetzung des toxischen Gd3+ führen.
Ein zweiter Ansatz zielt auf die Optimierung der Effizienz des Kontrastmittels ab. Dabei steht ein Parameter, die sogenannte Relaxivität im Vordergrund. Insbesondere bei MRT-Geräten mit einer verhältnismäßig geringen Magnetfeldstärke (0,5 bis 1,5 Tesla) kann eine starke Erhöhung dieses Wertes erreicht und damit eine enorme Steigerung der Effizienz des Kontrastmittels erzielt werden. Die Relaxivität lässt sich steigern, indem man die Beweglichkeit, vor allem die Rotationsgeschwindigkeit, des chelatierten Gadolinium(III)-Ions (quantifiziert als Rotationskorrelationszeit τr) einschränkt [3]. Dafür wiederum ist ein hohes Molekulargewicht des chelatierenden Moleküls vorteilhaft. Eine größere Masse des Moleküls lässt das chelatierte Kontrastmittel langsamer rotieren. Eine solche Steigerung des Molekulargewichtes wird zwar zum Teil auch beim Assembly-Ansatz erreicht, jedoch ist das chelatierte Kontrastmittel hier meist über längere, bewegliche Linkergruppen am Chelator an das Assembly gebunden. Dies verleiht den einzelnen verknüpften Chelatoren und damit dem Kontrastmittel eine hohe interne Flexibiliät, wodurch die Rotation zwar eingeschränkt wird, jedoch weiterhin noch große Anteile an Rotationsfreiheitsgraden erhalten bleiben. Zwar gelingt es heutzutage bereits auf Basis kleinmolekularer Chelatoren die Rotationskorrelationszeit bei nur geringer Zunahme des Molekulargewichtes zu steigern, allerdings liegen die erzielten Ergebnisse bei einer Feldstärke von 1,5 Tesla noch um mindestens einen Faktor vier von dem erreichbaren Optimum entfernt [1].

Biologicals als steuerbare Kontrastmittel

Hohe Relaxivitäten konnten bereits früh in der Entwicklung von Kontrastmitteln erreicht werden, bei denen kleinmolekulare Chelatoren an Serumalbumin gekoppelt wurden [4]. Diese Art von Kontrastmitteln ist allerdings auf Blutgefäße beschränkt. Noch höhere Relaxivitäten lassen sich bei Feldstärken bis 1,5 Tesla durch die direkte Kopplung des Gd3+ an ein Metallionen-bindendes Protein erreichen [5]. Dieser Ansatz wurde jedoch bisher wenig untersucht, da die kinetische Stabilität einer Bindung von Gd3+ an ein Protein deutlich geringer ist als die einer Bindung an kleinmolekulare Chelatoren.

Da durch die direkte Bindung aber hohe Relaxivitäten erreicht werden können, wurde in einer Kooperation der Institute für Bioinformatik und für Strukturelle und Medizinische Biochemie der Universität Duisburg-Essen sowie im Rahmen eines BMBF-Projektes (BMBF 01EZ0933) dieser bisher wenig untersuchte Ansatz der direkten Kopplung von Gd3+-Ionen an ein Protein für die Entwicklung eines neuen Kontrastmittels gewählt [6]. Ziel des Projektes war es, ein Kontrastmittel auf Proteinbasis zu entwickeln, das einfach rekombinant hergestellt wird, ohne zusätzliche chemische Kopplung fungieren kann und in der Lage ist durch modulare Kombination - im Baukastenprinzip - selektiv Tumormarkerprotein auf Krebszellen zu erkennen und zu binden. Um diesem proteinbasierten Kontrastmittel eine selektive Zielführung an verschiedene Tumore zu ermöglichen, sollte die Peptidkette um eine weitere Domäne ergänzt werden. Dafür wurde die Z‑Domäne [8], eine Doppel-Punktmutante der B‑Domäne des Proteins A aus Staphylococcus aureus, verwendet. Dieses Protein ist in der Lage, an den konstanten Bereich (Fc-Bereich) humaner Antikörper zu binden. In Kombination mit verfügbaren therapeutischen IgG-Antikörpern gegen Tumorzellen oder auch andere Zielstrukturen sollte somit eine modulare Zielführung ermöglicht werden.

Um hohe Relaxivitäten zu erreichen, wurde für einen ersten Versuch die S55D/E59D α‑Parvalbumin-Mutante der Ratte [7] verwendet. Diese bindet physiologisch zwei Ca2+-Ionen, kann aber aufgrund sehr ähnlicher Ionenradien auch Lanthanoidionen wie Gd3+ mit subpicomolarer Affinität binden. In Moleküldynamik-Simulationen, in denen beide Domänen über einen Dekaglycin-Linker zu einem Fusionsprotein vereint wurden (siehe Abb. 1) erwies sich das Konstrukt als stabil und erhielt den Namen Zarvin. Nach rekombinanter Herstellung des Fusionsproteins falteten sich beide Domänen korrekt und erfüllten ihre jeweilige Funktion in gleichem Maße wie die Einzeldomänen. Die Z-Domäne des Zarvins bindet dabei humane IgG-Antikörper mit einer Affinität, die in derselben Größenordnung liegt, wie es bei der freien Z-Domäne der Fall ist. Das System aus dem Fusionsprotein und einem monoklonalen IgG-Antikörper wurde beispielhaft mit Hilfe des anti-EGF-Rezeptor Antikörpers Cetuximab und der den EGF-Rezeptor in der Zellmembran überexprimierenden Zelllinie A431 [9] getestet (siehe Abb.  2). Die Parvalbumin-Domäne des Zarvins bindet analog zu dem einzelnen Protein Metallionen wie Gadolinium(III) mit hoher subpicomolarer Affinität. Die Faltung beider Domänen zeigte sich weiterhin als thermisch stabil mit Schmelztemperaturen oberhalb von 70 °C in der Metallionen-gebundenen Form sowie in vitro in fötalem Kälberserum als nicht suszeptibel gegenüber proteolytischem Abbau.

Mit einem Zarvin:(Gd3+)2-Komplex konnten u. a. bei der für die Tumordiagnostik relevanten Feldstärke von 1,5 Tesla hohe Relaxivitäten erreicht werden. Dies wird in der Kontrastmittel-Forschung i. d. R. durch ein sogenanntes NMRD-Profil (Nuclear Magnetic Resonance Dispersion) dargestellt, welches die Abhängigkeit der Relaxivität des Kontrastmittels von der verwendeten Feldstärke zeigt (siehe Abb. 2). Die erreichten Relaxivitäten bei etwa 1,5 Tesla liegen dabei deutlich über solchen, die mit Hilfe kleinmolekularer Chelatoren erreicht werden (etwa 4 - 10 mM-1×s-1).Trotz der starken Bindung der Lanthanoidionen an das Parvalbumin zeigte der Zarvin: (Gd3+)2-Komplex in Serumsflüssikeit nur eine geringe Halbwertszeit im Minutenbereich. Für eine in vivo Anwendung wären jedoch Halbwertszeiten mindestens im Bereich von mehreren Stunden erwünscht.

Was bleibt zu tun

Zukünftig zu lösende Probleme bei der direkten Kopplung von Gd3+-Ionen an Proteine bleiben daher die niedrigen kinetischen Stabilitäten dieser Interaktion unter in vivo Bedingungen. Auch die Interaktion der Z‑Domäne mit therapeutischen Antikörpern ist auf kinetischer Ebene noch nicht stabil genug, um in vivo eingesetzt zu werden, da in humanem Blutserum hohe Konzentrationen mit bis zu 16 mg / ml dieser Antikörper-Form vorkommen. Der therapeutische Antikörper würde nach Injektion in die Blutbahn schnell durch die Konkurrenz mit körpereigenen IgG-Antikörpern aus der Bindung mit dem Zarvin verdrängt werden. Die Verbesserung der kinetischen Eigenschaften beider Interaktionen ist daher Gegenstand weiterer Forschungen, um ein möglichst sensitives für die Tumor- und Metastasendiagnostik einsetzbares Kontrastmittel zu schaffen.

Literatur
[1] Caravan P.: Chem Soc Rev 35, 512-523 (2006)
[2] Caravan P. und Zhang Z. European journal of inorganic chemistry, 1916-1923 (2012)
[3] Caravan P. et al.: Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999)
[4] Caravan P.: Acc. Chem. Res. 42, 851-862 (2009)
[5] Yang J. J. et al.: J Am Chem Soc 130, 9260-9267 (2008)
[6] Grum D. et al.: PLoS ONE. 8(6): e65346 (2013)
[7] Lee Y.-H. et al.: Biochemistry 43, 10008-10017 (2004)
[8] Nilsson B. et al.: Protein Eng 1, 107-113 (1987)
[9] Giard D. J. et al.: J Natl Cancer Inst 51, 1417-1423 (1973)

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