Lusens: Zusammen besser als ein Tierversuch

Testbatterie als Alternativmethode für Allergene

  • Abb. 1: Bei Konflikten zwischen den einzelnen Tests wird der Weight-of-Evidence Ansatz angewandt (Schematische Darstellung)Abb. 1: Bei Konflikten zwischen den einzelnen Tests wird der Weight-of-Evidence Ansatz angewandt (Schematische Darstellung)

Um eine allergische Reaktion der Haut beim Kontakt mit einer chemischen Substanz möglichst zu vermeiden, müssen Substanzen vorab untersucht werden. Als Alternative zum Tierversuch wird hier eine Methode vorgestellt, die drei physiologisch relevante Methoden in einer Testbatterie kombiniert: (1) Die Aktivierung von Keratinozyten durch elektrophile Substanzen oder oxidativen Stress mit Hilfe eines Luciferase-Vektors, (2) die Analyse der Peptidreaktivität in chemico und (3) die Aktivierung dendritischer Zellen infolge des Kontakts mit einem Allergen.

Als natürliche Barriere zwischen dem Körper und der Umwelt wird unsere Haut ständig verschiedenen Reizen ausgesetzt. Dabei kann die Exposition mit einigen Substanzen zu einer Sensibilisierung und bei erneutem Kontakt zu einer allergischen Hautreaktion führen [1]. Während der Sensibilisierung binden allergene Stoffe an Proteine der Haut. Die so veränderten Proteine können zu Immunogenen werden und von unreifen dendritischen Zellen (DZ) der Haut aufgenommen werden. Wird gleichzeitig ein Gefahrensignal in der Haut gesandt, etwa durch eine Stressreaktion der Keratinozyten, setzt dies eine immunologische Reaktion in Gang. Die DZ reifen, wandern zu den Lymphknoten und präsentieren dort Epitope (Bruchstücke des veränderten Proteins) naiven T-Lymphozyten. In der Folge proliferieren und differenzieren die T-Lymphozyten, die speziell auf dieses Immunogen ‚trainiert' sind. Damit ist der Organismus sensibilisiert. Bei einem weiteren Kontakt mit der Substanz greifen diese T-Zellen an und es entsteht die typische Entzündungsreaktion der Haut, die allergische Kontaktdermatitis.

Derzeit wird das sensibilisierende Potential von chemischen Stoffen noch in Tierversuchen bestimmt, allen voran der lokale Lymphknotentest (local lymph node assay, LLNA). Der LLNA bestimmt die Zellproliferation aus den ableitenden Lymphknoten von Mäusen, denen die Testsubstanz auf die Haut der Ohren gebracht wurde [2]. Berücksichtigt man die Reach-Verordnung 1907/2006, die eine Charakterisierung von bis zu 30.000 Chemikalien bis 2018 vorsieht und die EU-Kosmetikverordnung 1223/2009, die ein Verbot von Tierversuchen für kosmetische Rohstoffe beinhaltet, wird der akute Bedarf einer Alternativmethode in diesem Bereich offensichtlich.

In vitro Testbatterie zur Untersuchung eines sensibilisierenden Potentials
Die Sensibilisierung ist ein komplexer biologischer Prozess, dessen Gesamtheit sich nicht in einem einzigen in vitro Testsystem darstellen lässt.

Wichtige Schritte dieses Prozesses kann man jedoch mit individuellen in vitro Methoden untersuchen. Hierzu gehören u.a. die Bindung der Testsubstanz an körpereigene Proteine, die Reifung dendritischer Zellen und die Aktivierung von Keratinozyten.

Die Bindung von Testsubstanzen an Proteine wird mit dem direct peptide reactivity assay (DPRA) untersucht. Hierbei wird die Bindung der Substanz an Peptide (als Ersatz für Proteine) gemessen, indem die Peptide mit der Substanz inkubiert werden und danach das nicht gebundene Peptid bestimmt wird. Die Reifung von DZ wird mit dem sogenannten h-Clat (human-Cell Line Activation Test) oder Mmusst (modified myeloid U937 skin sensitization test) untersucht. Das Prinzip beruht auf der Messung der Expression bestimmter Oberflächenmarker (CD86 bzw. CD54) auf gereiften dendritischen Zellen THP-1 bzw. U937 [3]. Die Aktivierung von Keratinozyten kann mittels keap1/Nrf2 basierten Methoden ermittelt werden, ein Beispiel ist im Folgenden beschrieben.

Luciferase-Vektor als Indikator für zellulären Stress
Die von der RWTH Aachen zusammen mit der BASF und dem Unternehmen Promega entwickelte Reportergenzelllinie „Lusens" wandelt elektrophilen und oxidativen Stress in der Zelle in ein Lumineszenzsignal um. Hierzu wurde ein modifizierter Luciferase-Vektor stabil in eine Keratinozyten-Zelllinie transfiziert. Der Vektor wird von dem antioxidant-response-element (ARE) kontrolliert, das ARE wird wiederum von Nrf2 aktiviert. Eine allergieauslösende Substanz kann in der Zelllinie Nrf2 freisetzen und so zu einer Expression der Luciferase führen [4]. In unserem Versuchsaufbau wurden die Lusens-Zellen für zwei Tage unter Standardbedingungen mit der Testsubstanz im Brutschrank inkubiert. Darauf folgend wurde die Luciferaseaktivität durch Zugabe eines Substrats bestimmt, das durch die Luciferase ein Lumineszenzsignal erzeugt. Eine ähnliche Methode wurde von der Schweizer Firma Givaudan entwickelt [5].

Weight-of-Evidence Ansatz
Der DPRA und der Lusens-Assay eignen sich gut, um Allergene mit hoher Sensitivität zu bestimmen. Daraus folgend kann man davon ausgehen, dass bei einem negativen Ergebnis im DPRA und dem entwickelten Assay mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer nichtsensibilisierenden Substanz gesprochen werden kann. Jedoch werden manchmal auch unbedenkliche Substanzen als Allergene eingestuft. Deshalb wurde ein dritter Test, der die Reifung dendritischer Zellen misst, hinzugenommen.

Stimmen die Ergebnisse der drei Tests nicht überein, wird ein Weight-of-Evidence Ansatz angewandt (Abb. 1): Mindestens zwei von drei Tests müssen positiv sein, um dieSubstanz als Allergen einzustufen, beziehungsweise mindestens zwei von drei Tests müssen negativ sein, um die Substanz als nicht sensibilisierend zu beurteilen.

Um die Leistungsfähigkeit dieser Kombination der drei Methoden zu prüfen, wurden 54 Substanzen untersucht deren allergenes Potential beim Menschen bekannt ist. Die Ergebnisse der in vitro Methoden wurden mit der tatsächlichen allergenen Wirkung am Menschen verglichen. Jeder Test allein hatte eine Vorhersagegenauigkeit um 80%. Der LuSens zusammen mit den zwei anderen Methoden erreichte eine Vorhersagegenauigkeit von 94 %.

Ausblick
Eine Vielzahl verschiedener in vitro Methoden zur Prüfung der sensibilisierenden Wirkung wird derzeit entwickelt [1]. Da eine einzelne Methode den komplexen Prozess der Hautsensibilisierung nicht ausreichend abbilden kann, werden Kombinationen verwendet, die die einzelnen Schritte nachbilden. Die vorgestellte Testbatterie konnte für 54 Substanzen die sensibilisierende Wirkung beim Menschen besser voraussagen als der gebräuchliche Tierversuch, der LLNA [6]. Sie ist schon heute einsetzbar und wurde bereits für einige Substanzbewertungen im Rahmen der europäischen Chemikalienregulierung, Reach, verwendet. Die Methoden sollen nun weiterentwickelt werden, um nicht nur zuverlässig anzeigen zu können, ob eine Substanz ein Allergen ist, sondern auch wie stark die allergene Wirkung ist.

Referenzen:
[1] Mehling, A.: Arch Toxicol 86, 1273-1295 (2012)
[2] Anger-Loustau, A.: Regulatory Toxicology and Pharmacology 60, 300-307 (2011)
[3] Bauch, C.: Toxicology in Vitro 25, 1162-1168 (2011)
[4] Natsch A.: Toxicol Sci. 113, 284-92 (2010)
[5] Natsch, A.: Toxicology in Vitro 25, 733-744 (2011)
[6] Bauch, C.: Regulatory Toxicology and Pharmacology, 63, 489-504 (2012)

Mehr Informationenzum Thema: http://bit.ly/Allergien

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