Medikamentenbestimmung in humanem Plasma

  • Abb.1: Metabolismus von Diphenylamin beim Menschen
  • Abb. 2: Metabolismus von Doxylamin im Menschen
  • Abb. 3: UV-Chromatogramm der Plasmaprobe vom Fall 1: 1 = Dinordiphenhydramin, 2 = Nordiphenhydramin, 3 = Diphenhydramin (DPH), 4 = Diphenhydramin-N-oxid, 5 = Hydrocortison und 6 = IS (N-Ethyloxazepam).
  • Abb.: 4: UV-Chromatogramm der Plasmaprobe vom Fall 2: 1 = Nordoxylamin, 2 = Doxylamin (DOX), 3-7 = Amitriptylin-Met#, 8 = Diphenhydramin (DPH), 9 = Hydrocortison, 10 = Nortriptylin, 11 = Amitriptylin und 12 = IS (N-Ethyloxazepam).
  • Formel 1
  • Tabelle 1: Therapeutische und kritische Konzentrationen, Arbeitsbereiche und Bestimmungsgrenzen von DOX und DPH

Eine akute Vergiftung ist eine medizinische Notfallsituation, bei der ein schneller, eindeutiger und zuverlässiger Nachweis und die Bestimmung der Fremdstoffkonzentration im humanen Material eine wichtige Voraussetzung für die differenzierte und erfolgreiche Behandlung des Patienten darstellt. Die toxikologische Analytik erfordert daher die ständige Verfügbarkeit des analytischen Instrumentariums. Zudem kann die Wettbewerbsfähigkeit eines Labors nur durch einen hohen analytisch-technischen Standard bei gleichzeitigem effektivem Einsatz aller Ressourcen gewährleistet werden.

Üblicherweise erfolgt die toxikologische Analyse aus Serum oder Plasma, da es praktisch immer verfügbar ist. Ferner korreliert die Konzentration der Wirkstoffe im Blut eher mit dem klinischen Bild des Patienten in Beziehung als ihre Konzentrationen im Urin. Für Wirkstoffe mit geringen Konzentrationen oder mit kurzen Halbwertzeiten in Blut kann die Urinanalyse jedoch wertvolle, qualitative Informationen liefern (1), (2). Beim Drogennachweis ist Urin das Untersuchungsmaterial der ersten Wahl, da die Fremdstoffsubstanzen noch nach Tagen in ausreichend hohen Konzentrationen nachweisbar sind (3). Aktuell wurde daher das im Institut für Toxikologie in Berlin (BBGes), gemeinsam mit. Shimadzu für die Urin-Analytik entwickelte, toxikologische Identifizierungssystem TOX.I.S. (1), um eine neue Methode für die quantitative Bestimmung von Substanzen in Plasma/Serum wesentlich erweitert. In dem vorliegenden Artikel werden exemplarisch zwei Vergiftungsfälle, die mit der neuen, quantitativen Plasma-Methode auf dem erweiterten TOX.I.S. analysiert wurden, präsentiert.

Einführung

Doxylamin (DOX) und Diphenhydramin (DPH) sind kompetitive Histamin H1-Rezeptorantagonisten der ersten Generation mit anticholinergen, hypnotischen, sedativen, lokal anästhetischen und antitussiven Eigenschaften (4), (5). Auf Grund ihrer erheblichen sedativen Wirkung, werden sie als OTC-Präparate gegen Unruhe und Schlafstörungen angeboten, gehören zu vergleichsweise, relativ häufigen Vergiftungen und werden oft in suizidaler Absicht eingenommen (6), (7). Innerhalb der letzten drei Jahre (01.01.2008 bis 31.12.2010) wurde am Institut für Toxikologie, klinischer Toxikologie und Giftnotruf Berlin aus 4509 bearbeiteter Vergiftungen in 86 Fällen DOX und in 70 Fällen DPH identifiziert und quantitativ bestimmt.

Zwischen 2007 und 2009 verzeichnete der Giftnotruf Berlin rund 1.200 Anfragen auf Vergiftungen mit DOX und/oder DPH (8).

Die wirksame tägliche Dosis von DPH liegt zwischen 30 und 100 mg (9) und von DOX zwischen 25 und 50 mg (10). Todesfälle wurden nach Dosen von 40 mg/kg DPH (11) bzw. 25-250 mg/kg DOX (12) beschrieben. Eine kombinierte Einnahme mit Alkohol, Cocain, Morphin, Barbituraten, Benzodiazepinen oder DPH führt zur Wirkungsverstärkung (13), (14). Die kritische Serumkonzentration wird für DOX mit 3 mg/L und für DPH mit 5 mg/L angegeben (8).

Bei DOX- oder/und DPH-Vergiftungen treten im Wesentlichen anticholinerge Symptome auf: Hautrötungen, trockene Schleimhäute, Koordinationsstörungen, Unruhe, Angst, Erregungszustände, Halluzinationen, in schweren Fällen Krampfanfälle, Herzrhythmusstörungen, Ataxie und motorische Unruhe. Letale Vergiftungen sind durch Koma, Herz / Lungenversagen und Grand Mal-Anfälle gekennzeichnet (15).

DPH wird stark an Plasmaeiweiße gebunden (85 bis 99 %); das Verteilungsvolumen beträgt 3-4 l/kg (16). Die Metabolisierung erfolgt hauptsächlich in der Leber (CYP2D6, CYP1A2, CYP2C9 und CYP2C19 (17)). DPH wird zunächst zu Mono- und Di-Desmethyldiphenhydramin dealkyliert und dann zu Diphenylmethoxyessigsäure oxydiert und an Glutamin bzw. Glycin konjugiert (Abb. 1). DPH wird hauptsächlich (ca. 60 % innerhalb von 96 Std.) in Form seiner Metaboliten über die Nieren ausgeschieden - maximal 1 % des Wirkstoffs erscheint unverändert im Urin (18), (19). Die Eliminationshalbwertzeit wird mit durchschnittlich 4 (2,4 bis 9,3) Stunden angegeben (16).

Die Metabolisierung von DOX erfolgt vorrangig in der Leber. N-Desmethyldoxylamin, N,N-Didesmethyldoxylamin und deren N-Acetyl-Konjugate wurden nachgewiesen (Abb. 2) (20), (21). Die Eliminationshalbwertszeit beträgt ca. 10 Stunden (21).

Fallbeschreibung:

Fall 1
Ein 28-jähriger Mann (185 cm, 85 kg) wurde ins Krankenhaus mit klinischen Symptomen einer Alkoholintoxikation eingeliefert. Sein Gesicht und seine Hände waren gerötet. Die Vergiftung durch die Einnahme der Medikamente wurde nicht ausgeschlossen.

Fall 2
Beim zweiten Fall handelt es sich um eine 41-jährige Frau (170 cm, 65 kg), die in einem verwirrten Zustand mit unkontrollierten Bewegungen ins Krankenhaus eingeliefert wurde. Die Frau litt an einer Depression. Der im Krankenhaus durchgeführte Urin-Schnelltest war positiv auf trizyclische Antidepressiva.

Materialien und Methoden

Chemikalien und Standards
Doxylaminsuccinat, Diphenhydraminhydrochlorid, Amitriptylinhydrochlorid, Nortriptylinhydrochlorid wurden von Sigma-Aldrich und N-Ethyloxazepam von Lipomed käuflich erworben. Die Stammlösungen (1,0  g/l) von Referenzsubstanzen wurden durch die Auflösung der Feststoffe in Methanol hergestellt. Die Interne Standardlösung (IS; c = 1  mg/l) wurde durch die Zugabe von N-Ethyloxazepam in Methanol hergestellt. Stammlösungen von Referenzsubstanzen und Interne Standardlösung wurden bei -20 °C gelagert. Acetonitril (gradient grade for HPLC) wurde von TH Geyer, Methanol (LC-MS-Grade) von Sigma-Aldrich käuflich erhalten. Ammoniumhydrogencarbonat (< 99 %) wurde von Sigma-Aldrich gekauft. Das Spenderplasma für die Herstellung dotierter Plasmaproben wurde von DRK Blutspendedienst Ost gemeinnützige GmbH (Institut Dresden, Deutschland) erhalten.

Apparativer Aufbau
Das toxikologische Identifizierungssystem (TOX.I.S.) setzt sich wie folgt zusammen: Degasser (2 x DGU-20A5), Pumpen (LC-20AT und LC-20 AB), Hochdruckventil (FCV-20H2), Säulenschaltventile (2 x FCV-14AH und 2 x FCV-12AH), Autosampler (SIL-20AC), Säulenofen (CTO-20AC), Photodiodendetektor (SPD-M20A) sowie Systemcontroller (CBM-20AC), alles Shimadzu.

On-line Extraktion
Für die Festphasenextraktion wurde eine Säule vom Typ Strata X (20 x 2,0 mm, 25 µm, Phenomenex) verwendet. Als Beladungspuffer wurde 0,01 M NH4HNO3 (pH = 9), zum Spülen Wasser (entmineralisiert) und für die Elution ACN:H2O (90:10, v/v) verwendet. Die Konditionierung der Extraktionssäule erfolgte durch ACN:H2O (90:10, v/v) und 0,01 M NH4HNO3 (pH = 9).

Probenvorbereitung
200 µl Plasmaprobe wurden mit 300 µl des internen Standards (N-Ethyloxazepam, c = 1,0 g/l) in Methanol gemischt. Anschließend wurde das Gemisch 5 min. bei 200 U/min geschüttelt und 4 min. bei ca. 14.500 x g zentrifugiert. Der Überstand (300 µl) wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 1,0 ml 0,1 M NH4HCO3 (pH = 9) verdünnt.

Chromatographische Bedingungen
Die chromatographische Auftrennung erfolgte auf einer C 18-Säule Gemini-NX (150 x 4.6 mm, 3 µm) mit einer Vorsäule gleichen Typs (4,0 x 3,0 mm; beides Phenomenex). Die mobile Phase bestand aus ACN:H2O (90:10, v/v) und 0,05 M KH2PO4 (pH = 9) zusammen. Die Gradientenelution erfolgte unter Variation der Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase (0,6 und 2,0 ml/min). Die Säulentemperatur betrug 40 °C, die UV-Detektionswellenlängen 210 bzw. 205 nm und das Injektionsvolumen 1,0 ml. Die Analyse (inkl. Extraktion) erfolgte innerhalb von 45 min.

Identifizierung und Quantifizierung
Die Substanz gilt als sicher identifiziert, wenn ihre relative Retentionszeit mindestens 95 % und der Spektrenvergleich mindestens 99 % Übereinstimmung mit der Bibliothek aufwies. Zur Berechnung der Konzentration wurde folgende Formel verwendet:

siehe Formel 1

Kalibratoren und Kontrollen
Für die 6-Punkt Kalibrierung wurde analytfreies, Human-Spenderplasma mit DOX/DPH dotiert (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 2,5 und 5,0 µg/ml). Jeder Punkt der Kalibriergeraden wurde durch Mittelwertbildung aus 10 Messungen des jeweiligen Kalibrators ermittelt. Zwei Kontrollen (0,6 und 1,2 mg/l) wurden analog den Kalibratoren hergestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Erste Versuche, die auf einen Verzicht der methanolischen Fällung ausgerichtet waren, führten zu einer vergleichsweisen kurzen Lebensdauer der Extraktionssäule (< 25 Injektionen). Erst durch die Verwendung von Methanol zur Fällung von Plasmaproteinen, konnte die Verwendbarkeit auf über 500 Injektionen/Extraktionssäule erhöht und gleichzeitig die Anzahl der Matrixpeaks reduziert werden. Für die Identifikation der Substanzen stand eine eigene Bibliothek, mit derzeit ca. 500 UV-Spektren sowie eine kommerzielle UV-Spektren Bibliothek (> 3000 Einträge) zur Verfügung. Die Kalibriergeraden von DOX (y = 67,25x) und DPH (y = 25,18x) zeigen eine Linearität mit Korrelationskoeffizienten > 0,999. Die unteren und oberen Bestimmungsgrenzen von DOX und DPH erlauben die quantitative Bestimmung beider Substanzen im Rahmen von Vergiftungen (Tabelle 1).

Die Kontrollen (1=0,6 und 2=1,2 µg/ml) wurden so ausgewählt, dass sie den unteren und oberen therapeutischen Bereich erfassen. Die Wiederholpräzision für die Kontrolle 1 (n = 8) betrug 6,2 % (DOX) bzw. 6,0 % (DPH), für die Kontrolle 2 (n = 8) 10 % (DOX) bzw. 8,5 % (DPH). Die tagesverschiedene Laborpräzision für die Kontrolle (n = 8) war 8,7 % (DOX) bzw. 9,3 % (DPH), für die Kontrolle 2 (n = 8) 7,5 % (DOX) bzw. 8,6 % (DPH).

Fall 1
Im Fall 1 konnte, entgegen dem Anfangsverdacht, durch die Analyse der Plasmaprobe mittels HS-GC kein Alkohol (c < 0,03 g/l) festgestellt werden. Mit dem TOX.I.S. wurden Coffein, Hydrocortison sowie 3,24 g/l DPH nachgewiesen (Abb. 3). Die Symptome des Patienten, wie Gesichtsrötung, Sprach- und Koordinationsstörungen und die im oberen therapeutischen Bereich liegende Konzentration sind daher wahrscheinlich auf die Einnahme von DPH zurückzuführen. Neben DPH wurden zusätzlich seine Hauptmetabolite Dinordiphenhydramin und Nordiphenhydramin qualitativ nachgewiesen (Abb. 3). Aderjan et al. weisen darauf hin, dass bei besonders starken sowie tödlich endenden Intoxikationen ein „Dreipeakmuster" aus Dinordiphenhydramin, Nordiphenhydramin und DPH im Chromatogramm auftreten können (9). Neben den genannten Substanzen wurde in der Plasmaprobe noch Diphenhydramin-N-oxid (Abb. 3, Peak 4) gefunden. Slikker et al. kamen zum Ergebnis, dass das Metabolitenprofil von DOX im Plasma und Urin ähnlich sind (22). Diphenylmethoxyessigsäure kann aufgrund gewählter Extraktionsbedingungen aus dem Plasma nicht extrahiert werden.

Fall 2
Im zweiten Fall wurden in der Plasmaprobe sowohl DOX, Nordoxylamin als auch DPH identifiziert (Abb. 4). Die Konzentrationen lagen bei < 0,25 mg/l (DOX) bzw. bei 0,29 mg/l (DPH) und damit im unteren therapeutischen Bereich. Zusätzlich konnten noch Amitriptylin, Nortriptylin und fünf unbekannte, polarere Amitriptylinmetabolite, bestimmt werden.

Für die Quantifizierung von Amitriptylin und Nortriptylin wurden Kalibratoren im Bereich zwischen 0 und 1,0 mg/l hergestellt. Jeder Kalibrator wurde n = 3 gemessen. Die Funktion der Kalibriergeraden für Amtriptylin lautet: y = 17,17x (R2 = 0,999) bzw. y = 9,40x (R2 = 0,999, Nortriptylin). Basierend auf diesen Funktionen wurde die Amitriptylin- bzw. Nortriptylinkonzentration im Patientenserum berechnet: Amitriptylin lag mit 0,084 mg/l im unteren therapeutischen Bereich (0,05-0,2 mg/l); Nortriptylin mit 0,16 mg/l im oberen therapeutischen Konzentrationsbereich (0,07 und 0,17 mg/l). Ferner konnte noch Hydrocortison (Abb. 4, Peak 9) nachgewiesen werden.

Zusammenfassung

Es wurde neue Methode zur Bestimmung von Medikamenten in Plasma mittels TOX.I.S. vom Institut für Toxikologie Berlin in Zusammenarbeit mit. Shimadzu entwickelt und die Leistungsfähigkeit der Methode anhand von zwei Beispielen exemplarisch dargestellt. Der Vorteil der Applikation liegt in der einfachen, Probenvorbereitung sowie in der automatischen Identifizierung und Quantifizierung von Fremdstoffen aus Plasma. Für die Identifizierung der Substanzen steht derzeit eine UV-Spektrenbibliothek mit ca. 500 Einträgen (RT, RRT) sowie eine kommerzielle UV-Spektrenbibliothek (> 3.000 Einträgen) zur Verfügung. Die in den UV-Spektrenbibliotheken hinterlegten Substanzen umfassen die gängigsten Medikamente (wie z.B. tricyclische Antidepressiva, Benzodiazepine, etc.) mit schwach sauren, neutralen und schwach basischen Eigenschaften sowie einiger ihrer Metabolite.

Danksagung

Die Autoren bedanken sich bei Shimadzu Europa für die technische Unterstützung.

Literatur
[1] Schönberg L. et al.: New screening method for basic compounds in urine by on-line extraction-high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection.
J of Chromatography A. 1134, 177-185 (2006)
[2] Björnstad K. et al.: A multi-component LC-MS/MS method for detection of ten plant-derived psychoactiv substances in urine. J of Chromatography B. 877, 1162-1168 (2009)
[3] Mckinnon A und Flanagan RJ. High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Basic Columns Using Non-Aqueous Ionic Eluents. J of Chromatogrphy. 17, 486, 191-225 (1985)
[4] Lee, YD und Lee, ST. Acute pancreatitis and acute renal failire complicating doxylamine succinate intoxication. Vet Hum Toxicol. 44, 3, 165-166 (2002)
[5] Walters-Thompson K. M. und Mason W. D.: Method for the Dermination of Diphenhydramine in Rabbit Whole Blood by High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) with Ultraviolet (UV) Detection in Conjugation with Gas Chromatography (GC) with Mass Selective Detection (MSD). Pharmaceutical Research. 9, 7 (1992)
[6] Köppel C. et al.: Poisoning with over the counter doxylamine preparations. An evaluation of 109 cases. J. Anal. Toxicol. 6, 355-359 (1987)
[7] Baker AM. et al.: Fatal diphenhydramine intoxication in infants. J. Forensic SCI. 48, 2, 425-428 (2003)
[8] Wintox, Laboreigener Datenbank. 2011.
[9] Aderjan R. et al.: Vergiftungen mit Diphenhydramin - Foresisch-toxikologische Beurteilung von Analysenbefunden. Z Rechtsmed. 88, 263-270 (1982)
[10] Gilamn AG et al.: The Pharmacological Basis of Therapeuttics. New York : 6th Edition, Macmillan, 1980.

Weitere Literatur ist direkt bei den Autoren erhältlich

Autor(en)

Kontaktieren

BBGes Berliner Betrieb für Zentrale Gesundheitliche Aufgaben (BBGes) - Institut für Toxikologie
Oranienburger Str. 285
13437 Berlin
Telefon: 030 / 30686 - 800
Telefax: 030 / 30686 - 812

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.