Nachweis aktinischer Keratosen

Entwicklung eines Fluoreszenzsensors zur Diagnostik

  • Abb. 1: Aufbau des Mehrkanal-FluoreszenzsensorsAbb. 1: Aufbau des Mehrkanal-Fluoreszenzsensors
  • Abb. 1: Aufbau des Mehrkanal-Fluoreszenzsensors
  • Abb. 2: Zweikanal-Fluoreszenzsensor mit Fremd¬licht¬unterdrückung. Links: Ausgestattet mit einer faseroptischen Eintauchsonde. Rechts: offenes Gehäuse: A, B: Empfangskanäle für die Fluores¬zenz¬detektion (Mess- und Referenzkanal), C: Lichtquelle mit UVA-LED, D: Eintauchsonde, E: Rückseite von Einschub C, F: Lüftergekühlter Kühlkörper zur Temperaturstabilisierung der UVA-LED, G: USB-Datenerfassung mit ADC, H: Netzteil und hintere Anschlüsse für USB und Netz.
  • Abb. 3: Oben: Fluoreszenzspektrum unbehandelter und behandelter Haut drei Stunden nach der Anwendung von 5-ALA-Salbe [2]. Weiterhin ist die Transmission der optischen Bandpassfilter zur PPIX-Detektion F1 (635 nm ± 15 nm) für den Messkanal und F2 (600 nm ± 10 nm) für den Referenzkanal dargestellt. Unten: Auf- und Abbaukinetik von PPIX: Zeitliche Entwicklung des PPIX-Fluoreszenzsignals nach Auftragen der 5-ALA Salbe auf die Haut eines linken Unterarms.

Am Institut für Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme der Hochschule Mannheim wurde ein Mehrkanal-Fluoreszenzsensor für den Einsatz in der Bioprozesskontrolle und medizinischen Diagnostik entwickelt. Der faseroptische Aufbau verwendet eine modulierte UVA-LED zur Fluoreszenzanregung. Durch die Anwendung eines elektronischen Lock-in Verfahrens können Fluoreszenzsignale auch dann noch ausgewertet werden, wenn sie von millionenfach intensiverem Umgebungslicht überlagert sind.

Die Fluoreszenzmesstechnik ist eine bedeutende analytische Methode in der Biotechnologie und der medizinischen Diagnostik [1]. Diese Methode ist sehr weit verbreitet, da sie nicht-invasiv und schnell ist sowie eine hohe Nachweisempfindlichkeit besitzt. Aufgrund des breiten Anwendungsspektrums haben sich verschiedene Konzepte der Fluoreszenzmessung etabliert.

Neben Spektrometeraufbauten können auch photometrische Sensoren zur Fluoreszenzmessung eingesetzt werden. Anstelle eines teuren Gittermonochromators werden in Photometern lediglich optische Bandpassfilter verwendet, deren Durchlassbereich für den jeweiligen Analyten spezifisch ist. Die Vorteile von Photometern im Vergleich zu Spektrometern sind die kompakte Bauweise, der wartungsarme Betrieb, die einfache Prozessanbindung sowie der niedrige Preis. Der hier vorgestellte faseroptische Fluoreszenzsensor ist robust und lässt sich durch Austausch der optischen Bandpassfilter für die jeweilige Anwendung schnell umrüsten. Als Anregungslichtquelle wird eine UVA-LED verwendet. Der Mehrkanal-Sensor ermöglicht die gleichzeitige Messung verschiedener Fluorophore wie NAD(P)H, Flavine und Porphyrine in der Prozesstechnik und Biomedizin [2]. In Hinblick auf einen Einsatz des Sensors bei der Fluoreszenz-Diagnostik (FD) und photodynamischen Therapie (PDT) von aktinischen Keratosen wurde die Auf- und Abbaukinetik des Photosensibilisators Protoporhyrin IX (PPIX) nach kutaner Applikation einer 20 %-igen (m/m) 5-ALA-Salbe untersucht.

Aufbau des Sensors
Der optische Aufbau des Mehrkanal-Fluoreszenzsensors (Abb.

1) besteht aus der UVA-LED als Anregungslichtquelle, einer faseroptischen Sonde sowie einem optischen Bandpassfilter plus Siliziumphotodiode in jedem der Empfangskanäle. Es wurden zwei Fluoreszenzsensoren entwickelt: Ein Sechskanal-Sensor für die Bioprozesskontrolle und ein Zweikanal-Sensor, um die PPIX-Kinetik in biomedizinischen Anwendungen verfolgen zu können. Als Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung wird eine Hochleistungs-UVA-LED eingesetzt (Typ NCSU033A, Nichia, Tokyo, Japan, λmax = 365 nm, spektrale Halbwertsbreite Δλ = 9 nm, optische Leistung ca. 300 mW). Die Beleuchtungsfaser ist direkt vor der UVA-LED platziert, um möglichst viel Licht für eine effiziente Fluoreszenzanregung einzukoppeln. Fluoreszierende Proben wie Haut-Zellen, Hefe-Zellen, etc. emittieren in der Regel diffus in alle Raumwinkel, sodass von der gesamten Fluoreszenzemission nur ein kleiner Teil in die Empfangsfasern eingekoppelt wird. In jedem Kanal führt eine Empfangsfaser zu dem jeweiligen optischen Bandpassfilter (F1...Fn) vor einer Si-Photodiode (D1...Dn). Der Durchlassbereich eines Bandpasses ist so gewählt, dass in diesem Kanal entweder ein Fluorophor selektiv detektiert werden kann oder ein Referenzsignal zur Verfügung gestellt wird. Das transmittierte Licht wird anschließend von der Si-Photodiode im Empfangskanal erfasst. Der Photostrom wird verstärkt und das Umgebungslicht durch ein Lock-in Verfahren unterdrückt. Das verstärkte Fluoreszenzsignal wird über eine USB-Datenerfassung zu einem Laptop übertragen und mit Hilfe eines Labview-Programms aufgezeichnet.

Der faseroptische Mehrkanal-Fluoreszenzsensor inkl. der elektronischen Baugruppen ist eine Eigenentwicklung des Instituts für Prozessmesstechnik und innovative Energiesysteme an der Hochschule Mannheim. Die Materialkosten für die zweikanalige Version (Lichtquelle, optische Bandpassfilter, Detektoren, Elektronik, Gehäuse und Eintauchsonde) betragen ca. 1.000 €. Abb. 2 zeigt den mit einer faseroptischen Eintauchsonde ausgestatteten Zweikanal-Sensor.

Fremdlichtunterdrückung
Ein Signalgenerator moduliert die LED mit Rechteckimpulsen einer definierten Frequenz. Durch die Modulation des UVA-Lichtes ist auch das von der Probe emittierte Fluoreszenzlicht mit derselben Frequenz moduliert. Ein Lock-in filtert alle Komponenten des Empfangssignals heraus, welche nicht die Modulationsfrequenz besitzen. Die Intensität des Umgebungslichts bei direkter Sensoreinstrahlung kann 103 W/m2 überschreiten und trotzdem ist es möglich, gleichzeitig Fluoreszenzsignale im Bereich von nur 10-3 W/m2 zu detektieren. Dabei ist die Höhe des Fluoreszenzsignals abhängig von der Fluorophorkonzentration, der Anregungswellenlänge und der Quantenausbeute. Selbst wenn die faseroptische Sonde direkt an einer Glühlampe (Leistung 40 W, max. Intensität 3200 W/m2) oder einer Leuchtstoffröhre (Leistung 36 W, max. Intensität 120 W/m2) platziert wird, ist eine vollständige Unterdrückung des Umgebungslichtes möglich. Der Fluoreszenzsensor kann demnach bei Raumlicht und im Freien bei Sonnenlicht ohne zusätzliche Abschirmung eingesetzt werden.

Biomedizinische Anwendung
Ein Beispiel für die biomedizinische Anwendung von Fluoreszenzmessungen ist der Nachweis von 5-ALA induziertem PPIX als Indikator für Neoplasien wie aktinische Keratose, Bowen-Hautkrebs und Basalzellkarzinom sowie als Photosensibilisator in der photodynamischen Therapie (PDT) [3]. Der Zweikanal-Fluoreszenzsensor wurde eingesetzt, um die Akkumulation und die Abbaukinetik von PPIX in gesunder Haut aufzuzeichnen. Vor den Messungen wurden 0,04 g einer frisch angesetzten hydrophilen Salbe mit einem Gewichtsanteil von 20% 5-ALA auf der Innenseite des linken Unterarms auf einer Fläche von 10 cm2 aufgetragen und mit einem Pflaster vor Licht geschützt. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Anwendung von 5-ALA zu einer intrazellulären Akkumulation von PPIX im Gewebe innerhalb weniger Stunden führt. PPIX fluoresziert rot, wobei das Maximum der Fluoreszenzemssion bei 635 nm liegt (Abb. 3, oben). Für die Bestimmung der Auf- und Abbaukinetik des photosensitiven PPIX wurde vor jeder Messung das Pflaster im abgedunkelten Labor entfernt und anschließend die Fluoreszenzintensität an fünf verschiedenen Stellen aufgenommen. Dabei wurde die faseroptische Sonde vertikal auf die Haut gesetzt. Die Messungen wurden über einen Zeitraum von drei Tagen im Abstand von mehreren Stunden wiederholt. Wie man in Abbildung 3 (unten) erkennt, wurde die maximale PPIX-Anreicherung in der Haut nach ca. acht Stunden festgestellt. Die dargestellten Messdaten konnten gut durch eine exponentielle Sättigungskurve angepasst werden, was auf eine Kinetik erster Ordnung hinweist.

Zusammenfassung
Es wurde ein einfach zu adaptierender, kompakter und robuster faseroptischer Fluoreszenzsensor entwickelt, welcher nicht auf Umgebungslicht anspricht. Als Lichtquelle für die Fluoreszenzanregung wurde eine UVA-LED verwendet. Die LED besitzt gegenüber Gasentladungslampen den Vorteil, dass sie eine lange Lebensdauer hat und ihre Lichtemission zeitlich moduliert werden kann. Die Modulation der Lichtintensität ermöglicht die Realisierung eines elektronischen Lock-in Verfahrens bei der Fluoreszenzdetektion und führt so zur Unterdrückung von Störsignalen wie Umgebungslicht. Die Kombination von Lock-in Verfahren mit der richtigen Auswahl der optischen Bandpassfilter führt dazu, dass selbst schwache Fluoreszenzsignale mit einem Signal- zu Rauschverhältnis von 1:1.000.000 noch detektiert werden können. Bei Hefe-Fermentationen konnten mit dem Mehrkanal-Fluoreszenzsensor gleichzeitig die Fluoreszenzemission von NAD(P)H, Flavine und Porphyrine aufgezeichnet werden [2]. In der Biomedizin lässt sich mit dem Sensor die Auf- und Abbaukinetik des Photosensibilisators Protoporphyrin IX in der menschlichen Haut verfolgen. Die Nachweisgrenze für PPIX lag bei 4∙10-11 mol/l. Somit kann der Fluoreszenzsensor sowohl bei der Prozessverfolgung in der Biotechnologie als auch in der biomedizinischen Diagnostik eingesetzt werden.

Danksagung
Diese Arbeiten wurden aus Haushaltsmitteln der Karl-Völker-Stiftung an der Hochschule Mannheim gefördert.

Literatur
[1] Lakowicz J R: Principles of Fluorescence Spectroscopy vol 3 (Berlin: Springer) (2006)
[2] Egly D et al.: Meas. Sci. Technol. 23 035702 (8pp) (2012)
[3] Juzenas P et al.: J. Photochem. Photobio. B. 67 11-17 (2002)

 

Mehr Informationen: http://bit.ly/Fluoreszenz
Labview Einsteiger-Seminare: http://bit.ly/GIT-Labview

Autor(en)

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Hochschule Mannheim
Paul-Wittsack-Str. 10
68163 Mannheim
Germany

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