Qualitätskontrolle von RNA

Vergleich von nativen Gewebeproben mit Gewebeproben nach Lasermikrodissektion

  • Abb. 1: Behandlung muriner Hirngewebeproben von Kryosektion über Lasermikrodissektion bis hin zur RIN-Analyse.Abb. 1: Behandlung muriner Hirngewebeproben von Kryosektion über Lasermikrodissektion bis hin zur RIN-Analyse.
  • Abb. 1: Behandlung muriner Hirngewebeproben von Kryosektion über Lasermikrodissektion bis hin zur RIN-Analyse.
  • Abb. 2: RNA-Qualitätsvergleich nativer, fixierter und gefärbter muriner Gewebeschnitte: Exemplarisch ist ein virtuelles RNA-Gel (links) sowie das zugehörige Elektropherogramm (rechts) eines Agilent RNA-Chips von RNA isoliert aus nativem Kryogewebe (nativ) und aus CV-gefärbtem, EtOH-fixiertem, UV-LMD-behandeltem Gewebe desselben Maushirns vor und nach Präzipitation der RNA (präzi) dargestellt. Die Elektropherogramme ergeben sich aus der Auftragung fluoreszierender Einheiten (FU) gegenüber der Laufzeit (in Sekunden [s]) (Schlaudraff, 2010).

Begründet in der Instabilität von RNA gestaltet sich das Arbeiten mit dieser prinzipiell komplizierter als mit DNA. RNA weist nicht die gleiche Stabilität wie die stabilere DNA-Doppelhelix auf. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, ist beim Umgang mit RNA das Vorhandensein bereits qualitativ hochwertigen Ausgangsmaterials ausschlaggebend und erfordert eine besonders sorgfältige Qualitätskontrolle vor und nach der Prozessierung. Hier gibt die sogenannte RIN (RNA Integrity Number) Aufschluss über die Qualität von RNA.

Auf einer Bewertungsskala von 1-10 geben RIN-Werte von 1 an, dass es sich um komplett degradierte RNA handelt und RIN-Werte von 10, dass die RNA vollständig intakt ist. Je höher der RIN-Wert, desto besser die RNA-Qualität, es sollte nach Möglichkeit mit hohen RIN-Werten gearbeitet werden.

Im Folgenden wird der Einfluss vorbereitender Fixier- und Färbeprozeduren sowie der sich anschließenden UV-Lasermikrodissektion von murinen Hirngewebeschnitten (post mortem) auf die RNA-Qualität dargestellt. Hierbei wurden die RIN-Werte kryoasservierter unbehandelter Mittelhirnsektionen mit nach standardisiertem Protokoll behandelten und isolierten Sektionen verglichen. Abbildung 1 zeigt den Ablauf hinsichtlich Probenbehandlung von Kryosektion bis hin zur RIN-Analyse.

Kryosektion mit anschließender Färbung und Fixierung
Für den Vergleich unbehandelter Gewebeproben mit fixierten und gefärbten Gewebeproben wurden drei kryoasservierte murine Mittelhirne mit bekannter RNA Integrität (RIN) verwendet. Diese ließen sich aus der Kryoasservierung bei -80°C zunächst in ein Kryomikrotom überführen und 45 min bei ‑35 °C inkubieren. Anschließend konnte das Gewebe 30 min bei -18 °C equilibriert und mittels Kryosektion bei -18 °C in 12 µm Sektionen geschnitten werden. Dabei wurden jeweils abwechselnd murine Mittelhirnsektionen direkt bei -80 °C eingefroren (Kontrollgruppe), sowie auf einem RNase-freien, UV-behandelten PEN-Objektträger aufgezogen. Dazu wurden die Sektionen bei Raumtemperatur kurz angetaut und 2 min in -20 °C gekühltem 75 %igen Ethanol fixiert und direkt nach der Fixierung mit einer sterilfiltrierten Cresylviolett (CV)-Färbelösung (1 % Cresylviolett in 100 % Ethanol) beträufelt und 45 sek.

unter leichtem Schwenken inkubiert. Nach diesem Färbeschritt wurde die Färbelösung kurz abgetropft, der Objektträger für jeweils 4 sek. in eine aufsteigenden Ethanol-Reihe (75 %, 95 % und 100 % Ethanol) getaucht und anschließend in 100 % Ethanol final fixiert (Testgruppe). Im Anschluss an diese Fixier- und Färbeprozedur wurde der Objektträger in einer Trockenkammer mit Kieselgel bei Raumtemperatur 45 min getrocknet und in der Trockenbox anschließend bei -80 °C bis zur Lasermikrodissektion gelagert.

Lasermikrodissektion
Nach Färbung und Fixierung wurde das aufgezogene Gewebe mittels UV-Lasermikrodissektion schonend und kontaminationsfrei isoliert. Dazu wurde das Gewebe mit Hilfe des 10x Objektives markiert und in Rechtecke aufgeteilt und mit ausreichender Energie vollständig mit dem „Draw + Cut"-Modus ablatiert. Die Dissektate wurden in 0,5 ml RNAse-freien Caps gesammelt und standen somit für eine Aufreinigung der enthaltenen RNA zur Verfügung. Diese wurden bis zur RNA-Isolation bei -80°C gelagert.

Parallele RNA-Isolation
Sowohl die unbehandelten, bei -80°C gelagerten, als auch die fixierten gefärbten und mittels Lasermikrodissektion gesammelten Proben wurden parallel aufgetaut und gleichzeitig mit den gleichen Reagenzien behandelt. Zur Aufreinigung wurde ein RNeasy Mini Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben eingesetzt. Die Elution der aufgereinigten RNA erfolgte mit 30 µl RNase-freiem Wasser in ein frisches, RNase-freies Reaktionsgefäß.

Vergleich der RIN-Werte hinsichtlich RNA-Qualität
Zum Vergleich der RNA-Qualität nativer Kryo-Gewebeschnitte mit CV-gefärbten, EtOH-fixierten, lasermikrodissektierten Gewebeschnitten wurde RNA der unterschiedlich behandelten Proben auf demselben RNA-Nano-Chip (Agilent Bioanalyzer) auftragen. Der Chip trennt RNA-Proben Gelelektrophoretisch auf und stuft die Proben nach Qualität aufgrund Ihres Laufverhaltens im Chip ein. Die Qualität wird als RIN-Wert wiedergegeben, wobei ein RIN-Wert von 10 komplett intakte und ein RIN-Wert von 1 komplett degradierte RNA anzeigt.
Anhand der hier durchgeführten RIN-Wertbestimmung (Beispielmessung Abb. 2) konnte gezeigt werden, dass die RIN-Werte von RNA aus direkt eingefrorenem, nativem Gewebe keine wesentlichen Unterschiede zu den nach dem beschriebenen UV-LMD Standardprotokoll behandelten Proben aufwiesen.

RNA-Präzipitation
Weiterhin wurden die isolierten RNA-Proben aufgeteilt und eine Hälfte präzipitiert. Nach RNA-Präzipitation (entsprechend den Anweisungen aus „Improved quantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells", Liss, 2002) waren die RIN-Werte der Gewebeproben aus nativem, präzipitiertem Kryogewebe etwas geringer als der RIN-Wert von RNA aus CV-gefärbtem, EtOH-fixiertem, UV-LMD behandeltem Gewebe. Der Unterschied lässt sich auf das verwendete poly-I des Präzipitationsmixes zurückführen, diese kurzsträngigen RNA-Moleküle werden z. T. mit aufgereinigt und bei der RIN-Bestimmung im Chip mitdetektiert und als degradierter Anteil ermittelt. In qPCR-Reaktionen weist das poly-I keinen negativen Einfluss auf. Fixierung, Färbung und UV-Lasermikrodissektion der Hirnschnitte, sowie gegebenenfalls eine RNA-Präzipitation haben demnach keinen negativen Einfluss auf die RNA-Qualität. Abbildung 2 zeigt einen RNA-Qualitätsvergleich nativer, fixierter und gefärbter muriner Gewebeschnitte.

Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die UV-Lasermikrodissektion mit der beschriebenen Methode die RNA-Qualität von kryoasserviertem Mittelhirngewebe nicht signifikant verringert. Derartige Verfahren bieten eine angemessene Methode zur Probenvorbereitung und schonender Isolation einzelner Zellen mit darauf folgender Gewinnung qualitativ unveränderter RNA.

Autoren
Cornelia Gilbrich, B.Sc, Wissenschaftsredakteurin und Dr. Falk Schlaudraff, Product Manager Laser Microdissection, Leica Microsystems CMS

 

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