Quantitative Verteilungsanalyse von Metallen mittels LA-ICP-MS

BrainMet als eine neuartige Zukunftstechnologie

  • Abb. 1: Experimentelle Anordnung zur Laserablations-ICP-MS und einige charakteristische Verteilungsbilder von GehirnschnittenAbb. 1: Experimentelle Anordnung zur Laserablations-ICP-MS und einige charakteristische Verteilungsbilder von Gehirnschnitten
  • Abb. 1: Experimentelle Anordnung zur Laserablations-ICP-MS und einige charakteristische Verteilungsbilder von Gehirnschnitten
  • Abb. 2: LA-ICP-MS Verteilungsbilder essentieller Metalle und der Nichtmetalle C, P und S in einem Kontroll-Rattenhirnschnitt (Dicke: 30 µm)
  • Abb. 3: Anwendungsfelder der bildgebenden Massenspektrometrie mit LA-ICP-MS
  • Dr. habil. J. Sabine Becker, Forschungszentrum Jülich

Metalle und Metalloproteine spielen eine wichtige Rolle im Gehirn, insbesondere auch bei der Bildung abnormer makromolekularer Aggregate und Präzipitate bei diversen Krankheiten. Neuartige laserinduzierte massenspektrometrische Techniken wurden im Rahmen von BrainMet (Bioimaging of Metals in Brain and Metallomics) etabliert, um Metall- und Metalloprotein-Verteilungen in dünnen biologischen Gewebeschnitten zu studieren. Dies geschah speziell in Proben degenerativ erkrankter Hirne, menschlicher und von Modelltieren, jeweils im Vergleich zu gesunden Kontrollproben. Ziel der Studien ist es, die den Krankheiten zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen.

Die Bedeutung von Spurenmetallen in den Neurowissenschaften ist erst zu Beginn des 21. Jahrhunderts in den Mittelpunkt des Interesses gerückt. So sind vor allem die Übergangsmetalle Cu, Zn, Fe und Mn für den menschlichen Organismus lebensnotwendig, da sie an wichtigen zellulären Prozessen im Gehirn beteiligt sind. Bekanntlich sind Metallspuren in etwa einem Drittel der körpereigenen Eiweiße (wie z. B. in Metalloproteinen wie Hämoglobin) bzw. in Metalloenzymen enthalten. Beispielsweise katalysiert das körpereigene Enzym Cu-Zn-Superoxidase (SOD) biochemische Reaktionen, indem es mit seinen antioxidierenden Eigenschaften als Radikalfänger freier reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wirkt und die Zelle vor Alterungsprozessen und oxidativem Stress schützt.

Motivation von BrainMet

Essentielle Spurenelemente sind im biologischen Gewebe i. A. inhomogen verteilt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass bei neurodegenerativen Erkrankungen, aber auch bei Hepatitis und Tumoren sich die Verteilung und die Konzentra­tionen von Metallionen und metallhaltigen Proteinen im Gewebe der betroffenen Organe im Vergleich zum gesunden Gewebe ändert. Während zu niedrige Konzentrationen essentieller Metalle zu Mangelerscheinungen im Organismus (z. B. Cu-Defizit infolge einer Stoffwechselstörung im Menkes-Syndrom) führen können, erweisen sich zu hohe Konzentrationen eben dieser Metalle im Organismus als hoch toxisch. Beispielsweise wird bei Morbus Wilson, einer angeborenen Cu-Speichererkrankung, eine abnormale Akkumulation von Kupfer in Leber und Gehirn als Folge eines Gendefektes der membranären Cu-Effluxpumpe ATP7B beobachtet.

Diese Kupferanreicherungen können zu schweren Zellschädigungen bis hin zum Zelltod führen.

Metalle (speziell die redox-aktiven Metall­ionen der Übergangsmetalle) sind wesentlich bei der Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Die neurotoxische Wirkung von Übergangsmetallionen wird speziell im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit intensiv diskutiert. Bekannt ist, dass Metallionen an das Amyloid Precursor Protein (APP) und seine abnormalen Beta-Amyloid Peptidfragmente binden und seine Aggregation die unlöslichen Amyloid-Plaques im Gehirn hervorrufen. Auch konnte nachgewiesen werden, dass ein weiteres Targetprotein der Alzheimer Erkrankung, das Tau-Protein, das im gesunden Zustand die neuronalen Mikrotubuli stabilisiert, sowohl durch Hyperphosphorylierung als auch durch Metalloproteinbildung funktionsuntüchtig wird und neurofibrilläre Tangles (PHF - paired helical filaments) bildet. Auch bei anderen Erkrankungen des Gehirns wie Morbus Hungtington, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), bipolare Erkrankungen, Epilepsie und Tumoren sind Metalle von Bedeutung. Andererseits werden metallhaltige Medikamente für gezielte Behandlungen eingesetzt. So finden Platinverbindungen (mit Cisplatin als bekanntestes Zytostatikum) in der Tumortherapie und Lithiumsalze bei der Therapie bipolarer Erkrankungen eine breite Anwendung.

Über quantitative Verteilungen von Metallen und Metalloproteinen in Gewebeschnitten in erkrankten Gehirnproben im Vergleich zum gesunden Gewebe sind jedoch nur wenige Untersuchungen bekannt.

Verschiedenste bildgebende Verfahren sind in der Medizin unverzichtbar für eine ortsaufgelöste medizinischen Diagnostik. Zu den etablierten Verfahren gehören neben der Röntgendiagnostik (wie z. B. der Computertomographie), der Magnet­resonanztomographie (MRT) und die Verfahren der Nuklearmedizin unter Verwendung radioaktiver Tracer wie z. B. Positronen-Emissions-Tomographie - PET und die Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT). Diese bildgebenden Verfahren liefern wichtige Informationen zur Anatomie des untersuchten Objektes, zur Diagnose krankheitsbedingter Änderungen oder zu chemischen Funktionalität des untersuchten Organs oder Gewebes. Ortsaufgelöste Verteilungsbilder von essentiellen und toxischen Spurenmetallen in medizinischen Proben können nicht oder nur in einigen ausgewählten Fällen von einzelnen Metallen (wie beispielsweise Fe-Ablagerungen im Gewebe oder die Analyse Gadoliniumhaltiger Kontrastmittel mit MRT) erhalten werden. Die Nachweisempfindlichkeiten reichen oft nicht aus, um besonders Spurenmetallverteilungen in Gewebeproben quantitativ mit hoher Ortauflösung zu erhalten. Hier bedarf es nachweisstarker ortsaufgelöster analytischer Techniken mit Multielementfähigkeit.

Bildgebende Massenspektrometrie der Metalle

Mit der LA-ICP-MS (Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) lassen sich geringste Änderungen der Metallverteilungen in dünnen Gewebeschnitten beobachten. In den letzten Jahren wurden am Forschungszentrum Jülich leistungsfähige Imaging-Techniken entwickelt, mit denen es möglich ist, quantitative Elementverteilungsbilder mit hoher räumlicher Auflösung im Mikrometerbereich zu erhalten. Dabei wird Gewebe auf einem Objektträger mit einem fokussierten Laserstrahl in einer mit Argon gefüllten Ablationskammer Zeile für Zeile vollständig abgetragen. Das ablatierte Probenmaterial wird mit Argon in ein (6.000 - 8.000 °C) heißes Argonplasma transportiert, in dem die Probenmoleküle unter Normaldruck dissoziiert und ionisiert werden. Die im induktiv gekoppelten Plasma (ICP) gebildeten, positiv geladenen Ionen werden über ein Interface in ein Massenspektrometer extrahiert, wo sie nach dem Masse / Ladungsverhältnis getrennt und detektiert werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Aufbau zur LA-ICP-MS und einige ausgewählte charakteristische Verteilungsbilder von Metallen in Gehirnschnitten unterschiedlichen Ursprungs, die mit der neuen BrainMet-Technik erhalten wurden. So ist beispielsweise eine unilaterale Eisenanreicherung in Substantia Nigra des Parkinson Maushirnschnittes deutlich zu erkennen.

Die Ziele und Schwerpunkte der Technik beinhalten die Entwicklung der massenspek­trometrischen Imaging-Techniken, um u. a. den Zusammenhang von Metallionen, Metalloproteinen, deren Verteilungen in Gehirnproben mit neurodegenerativen Erkrankungen zu verstehen, bzw. neue Diagnosetechniken für Therapien zur Verfügung zu stellen, die mit den bildgebenden Verfahren der Medizin (PET, MRI, Autoradiographie, Immuno- und Histochemie) kombiniert werden.

Anwendungsfelder

Mit den etablierten BrainMet Techniken lassen sich die Verteilungsbilder nahezu aller Metalle (Zn, Cu, Fe, Mn, Ni, Ti, Na, K, Ca, Mg, Mo u.a.), aber auch von Metalloiden (As, Se) und ausgewählter Nichtmetalle (z. B. C, S, Cl, I) erhalten. Das Analysenverfahren erweist sich während Routinemessungen als robust, die Ergebnisse sind hoch reproduzierbar und es werden plausible Verteilungsbilder erhalten, die die bekannte Architektur der untersuchten Gewebeschnitte exakt darstellt. So korrelieren die gemessenen Elementverteilungsbilder an Hirnschnitten gesunder Nager (Ratte oder Maus) mit den bekannten anatomischen Strukturen in dünnen Gewebeschnitten (z. B. Paxinos and Watson / Franklin Mouse brain atlas in stereotaxic coordinates). Man beobachtet vor allem, dass die Metalle in der grauen Hirnsubstanz (z. B. in verschiedenen Schichten des Cortex oder des Hippocampus) angereichert sind, während die Nichtmetalle (C, S und P) mit höheren Konzentrationen in der weißen Hirnsubstanz (z. B. Corpus Callosum) vergleichsweise zur grauen Hirnsubstanz nachgewiesen werden. Einige ausgewählte Verteilungsbilder, die an einem Kontroll-Rattengehirnschnitt (Dicke: 30 µm) mit LA-ICP-MS erhalten wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Neben der Verteilung essenzieller Metalle in Gewebeschnitten konnten wir auch toxische Spurenelemente (As, Hg, Pb, U, Th) in biologischen Proben mit hoher Empfindlichkeit und Ortsauflösung detektieren. Die Ergebnisse der bildgebenden Massenspektrometrie werden durch Untersuchungen der Bindung der Metalle an Biomoleküle (Metallomics) ergänzt.

Eine sehr erfolgversprechende Anwendung der LA-ICP-MS ist die ortsaufgelöste Analytik an einzelnen Haaren, um beispielsweise die Therapie mit metallhaltigen Pharmazeutika zu überwachen oder mögliche Kontaminationen des Körpers mit toxischen Metallen zu detektieren. Bereits an einem einzigen Haar konnte im Nachhinein der genaue Verlauf der Chemotherapie mit Cisplatin eines Ovarialkarzinoms mit mehreren Einzelgaben (Zyklen) nachvollzogen werden. Dies ermöglicht die Abschätzung des Dosisexposition in den nachfolgenden Therapie-Zyklen. Weitere Anwendungsfelder der bildgebenden Massenspektrometrie an biologischen Proben, einschließlich Biomonitoring von Pflanzen und Organen von Tieren, sind in Abbildung 3 zusammengefasst. So lässt sich die Kinetik chemischer Prozesse in den Lebenswissenschaften erfolgreich massenspektrometrisch unter Verwendung hochangereicherter stabiler Isotope in Tracerexperimenten studieren. Stabile Isotope werden auch für Untersuchungen zur Bildung von Metalloproteinen eingesetzt, sie erlauben eine zuverlässige Quantifizierung einer Vielzahl von Spurenelementen mit Hilfe der Isotopenverdünnungsanalyse.

Anwendungen im Nanometerbereich - zukünftige Entwicklungen

Die bildgebende LA-ICP-MS lässt sich auch in der Mikro- und Nanoelektronik einsetzen. Für neuartige Anwendungen in den Lebenswissenschaften und der Nanoelektronik werden derzeit die Techniken mit dem Ziel weiterentwickelt, das räumliche Auflösungsvermögen vom Mikrometerbereich bis in den Subnanometer und Nanometerbereich zu verbessern.

Dazu wurden im Wesentlichen im Labor zwei inzwischen patentierte Lösungsvorschläge entwickelt.

Nahfeld-Laserablation-ICP-MS

Hierbei wird ein Laserstrahl an der Spitze einer dünnen Silbernadel fokussiert, wobei sich Laserkrater von einigen hundert nm erzeugen lassen. Der Abstand zwischen Probenoberfläche und Ag-Spitze wird mit einer AFM (atomic force microscopy) Kontrolleinheit reguliert.

Lasermikrodissection-ICP-MS

Die Lasermikrodissection-ICP-MS wurde als online Kopplung einer geeigneten Lasermikrodissektions- (LMD) Apparatur mit einem ICP-MS im BrainMet-Labor erstmalig aufgebaut und entwickelt. Die LMD-ICP-MSI wird zur Bildgebung von Metallen bei einem Ortsauflösungsvermögen (5 bis 0.3 µm) in biologischen Proben eingesetzt.

Mit Nano-BrainMet werden zukünftig Verteilungsanalysen an einzelnen Zellen, Zellorganellen (z. B. Mitochondrien oder quantitative Zn-Verteilungen an Synapsen) möglich sein.

Derzeit wird die Kombination der Elementbildgebung (unter Verwendung der LA / LMD-ICP-MSI) mit der molekularer Bildgebung (MALDI-MSI) weiter vorangetrieben. Eine DFG-Förderung zur Großgeräteinitiative „Bildgebende Massenspektrometrie in den Lebenswissenschaften" ermöglichte die Anschaffung eines LMD mit einem geeigneten Laser zur Ablation biologischer Proben und eines MALDI-Orbitrap-Massenspektrometers zur Verteilungsanalyse von Metalloproteine für zukünftige Anwendungen in der Medizin.

Danksagung

Der Autor dankt der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG - BE 2649 / 5-1) und Thermo Fisher Scientific für die instrumentelle Unterstützung des Forschungsprojektes.

Eine Literaturliste ist online unter www.brainmet.de erhältlich. Die Grundlagen zur bildgebenden Massenspektrometrie sind in dem Lehrbuch von J. Sabine Becker „Inorganic Mass Spectrometry, Principles and Applications", J. Wiley & Sons 2007 beschrieben.

Autor(en)

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52428 Jülich
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