Rekombinante Proteine: Anwendung in Therapie und Diagnostik

  • Abb. 1: Prinzip der Proteingewinnung aus IBs. A, Escherichia coli-Zelle mit IBs (dunkle Bereiche); B –D, Schematische Darstellung von Protein in IBs (B), von solubilisiertem Protein (C) und einem Gemisch bestehend aus nativen und fehlgefalteten Spezies (rot) (D); E, Reinigung durch Chromatographie- Schritte; F, Gereinigte native Spezies. Erläuterungen im Text.Abb. 1: Prinzip der Proteingewinnung aus IBs. A, Escherichia coli-Zelle mit IBs (dunkle Bereiche); B –D, Schematische Darstellung von Protein in IBs (B), von solubilisiertem Protein (C) und einem Gemisch bestehend aus nativen und fehlgefalteten Spezies (rot) (D); E, Reinigung durch Chromatographie- Schritte; F, Gereinigte native Spezies. Erläuterungen im Text.
  • Abb. 1: Prinzip der Proteingewinnung aus IBs. A, Escherichia coli-Zelle mit IBs (dunkle Bereiche); B –D, Schematische Darstellung von Protein in IBs (B), von solubilisiertem Protein (C) und einem Gemisch bestehend aus nativen und fehlgefalteten Spezies (rot) (D); E, Reinigung durch Chromatographie- Schritte; F, Gereinigte native Spezies. Erläuterungen im Text.
  • Abb. 2: Verlauf der Herstellung eines humanen Knochenwachstumsfaktors aus IBs. Gezeigt sind die einzelnen Schritte beginnend vom Zellextrakt bis zum homogenen, nativen Produkt, das als disulfidverbrücktes Dimer vorliegt. Die Proben wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE aufgetrennt.

Die rekombinante Herstellung von Proteinen ist seit Jahren eine feste Wirtschaftsgröße. Obgleich auf den ersten Blick nicht offensichtlich, beruht die Nutzung rekombinanter Proteine für Therapie und Diagnostik vor allem auf Kenntnissen zur Biophysik der Proteinfaltung. Die Zusammenhänge zwischen grundlagenorientierter Proteinfaltung und technischer Herstellung sowie grundlegende Prinzipien der rekombinanten Proteinproduktion sollen hier dargestellt werden.

Medizinisch und diagnostisch genutzte Proteine sind aus Kosten- und Risikogründen vor allem rekombinante Proteine: So ist die Herstellung aus heterologen Wirten zum einen sicherer, weil Kontaminationen mit Krankheitserregern nahezu ausgeschlossen werden können und zum anderen wegen der geringen Extraktionskosten günstiger als die Gewinnung aus endogenen Quellen oder Geweben. Zudem stellen rekombinante Proteine hinsichtlich ihrer Eigenschaften häufig „verbesserte" Produkte dar, die durch gentechnische Methoden, also Mutagenesen verändert wurden. Ziel der Biotechnologie ist es, Proteine zu erzeugen, die eine hohe Stabilität und Spezifität besitzen und für die entsprechende Anwendung besonders gut geeignet sind. Bei der Behandlung von Tumoren beispielsweise sollten die Wirkstoffe eine gute Gewebepenetration aufweisen. Weiterhin dürfen therapeutische Proteine nicht immunogen wirken, also im Patienten keine Immunabwehr gegen den Wirkstoff hervorrufen.

Faltung rekombinanter Proteine
Die meisten therapeutisch und viele diagnostisch genutzte Proteine sind sezernierte Pro­teine, die im Extrazellulärraum wie z. B. in der Blutbahn ihre biologischen Funktionen erfüllen. In der Regel besitzen diese extrazellulären Proteine mehrere Disulfidbrücken. Die korrekten Verknüpfungen dieser Disulfidbrücken sind für die native Konformation und damit biologische Aktivität der Proteine essentiell. Entsprechend müssen sie in den rekombinanten Proteinen vorliegen, damit die Funktion des jeweiligen Proteins erfüllt wird. Die Oxidation der Sulfhydrylgruppen von Cysteinen zu Disulfidbrücken setzt ein oxidierendes Milieu voraus.

Dies ist im zellulären Cytoplasma nicht gegeben, da dort reduzierende Bedingungen vorliegen. Ein oxidierendes Mil­ieu liegt in aeroben Bakterien wie Escherichia coli, die am besten für die prokaryotische Protein-Produktion geeignet sind, im Periplasma vor. Das Periplasma ist der Raum zwischen der Cytoplasmamembran und der Zellwand. Bei Eukaryoten werden Disulfidbrücken in sekretorischen Kompartimenten wie dem endo­plasmatischen Retikulum oxidiert. Die Oxidation zu Disulfidbrücken bzw. deren Isomerisierung sind katalysierte Reaktionen, die von den entsprechenden „Redox"-Enzymen vermittelt werden.

Wie kann nun gewährleistet werden, dass die Proteine die korrekten Disulfidbrücken besitzen? Grundsätzlich kommen für die Produktion in heterologen Wirtszellen zwei Verfahren zur Anwendung: i) die Sekretion in den Extrazellulärraum bzw. Kulturüberstand oder ii) die Herstellung der Proteine im Cytoplasma der Wirtszellen, verbunden mit einem anschließenden „Aufbau" der Disulfidbrücken.

Bei Anwesenheit von Signalpeptiden, welche die Sekretion vermitteln und durch gentechnische Methoden den kodierenden Nukleinsäuren „vorgeschaltet" werden können, wird ein Transport in sekretorische Kompartimente sichergestellt. Dort faltet das Protein in die native Konformation bei gleichzeitiger, enzymkatalysierter Ausbildung der Disulfidbrücken. Natives Protein kann durch geeignete Techniken wie osmotischen Schock aus dem Periplasma gram-negativer Bakterien erhalten werden. Im Fall der Produktion in Säuger-Zellen, kann das Protein aus dem Kulturüberstand erhalten werden. Nach mehrfachen Reinigungsschritten, die später im Text noch anhand von Beispielen genannt werden, kann das rekombinante Protein schließlich in homogener Form für die Diagnostik oder Therapie eingesetzt werden. Die Nutzung von Säuger-Zellen als Wirtszellen ist vor allem bei der Gewinnung von Antikörpern für die Therapie oder Diagnostik das klassische Produktionsverfahren. Durch Einsatz dieses Wirtssystems ist häufig auch gewährleistet, dass posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen, welche die Aktivität und Halbwertszeit des Antikörpers beeinflussen, optimal ausgeprägt sind.

Inclusion Bodies
Aber auch die Herstellung im Cytoplasma von Wirtszellen findet Anwendung. Wie zuvor bereits erwähnt, setzt die Ausbildung von Disulfidbrücken ein oxidierendes Milieu voraus. Die reduzierenden Bedingungen im Cytoplasma führen dazu, dass Proteine, die in der nativen Konformation Disulfidbrücken besitzen, innerhalb der Zellen diese funktionelle, native Struktur nicht annehmen können. Vielmehr lagern sich die Proteine in Einschlusskörpern oder inclusion bodies (IBs) ab. Diese IBs enthalten das rekombinante Protein in inaktiven, fehlgefalteten oder sogar ungefalteten Strukturen. Aufgrund ihrer hohen Dichte können die IBs nach Zellaufschluss durch einfache Zentrifugationsschritte sedi­mentiert werden. Das in den IBs enthaltene, aggregierte und denaturierte Pro­tein kann durch Denaturierungsmittel oder Detergenzien solubilisiert, also in Lösung gebracht werden (Schema der Gewinnung von Protein aus IBs in Abb. 1).

Rückfaltung von rekombinanten Proteinen
Für die Solubilisierung von IBs kommt häufig die Zugabe von Guanidiniumchlorid in einer End-konzentration von 6 M zur Anwendung. Die meisten Proteine werden bei dieser Konzentration des Denaturierungsmittels vollständig entfaltet und liegen deshalb in nicht definierten, unstrukturierten Zuständen vor. Um eine Rückfaltung in die native Konformation zu erreichen, muss das Denaturierungsmittel weitgehend entfernt werden. Dies kann durch Verdünnung oder Dialyse erfolgen. Die Zusammensetzung des Renaturierungspuffers wird oft empirisch ermittelt. Damit nicht zu zahlreiche zeit- und kostenintensive Experimente durchgeführt werden müssen, kann man sich an Standardprotokollen orientieren [1]. Sobald Bedingungen, also eine Zusammensetzung des Puffers gefunden ist, die eine Rückfaltung ermöglichen, kann optimiert werden, damit hohe Ausbeuten an renaturiertem Protein erreicht werden können. Einige der Aspekte, die den Erfolg einer Renaturierung beeinflussen, sind im Folgenden dargestellt.

Bei der Konzipierung geeigneter Rückfaltungsbedingungen sind folgende biochemische und biophysikalische Aspekte zu berücksichtigen:

  • 1. Die Konzentration des Denaturierungsmittels muss gering genug sein, damit eine Faltung zur nativen Struktur möglich ist. Als Faustregel kann davon ausgegang­en werden, dass bei einer Guanidiniumchlorid-Konzentration geringer als ca. 0,2 M eine Rückfaltung erfolgen kann.
  • 2. Die Proteinkonzentration sollte niedrig sein, da bei hohen Konzentrationen nicht-nativer Spezies Aggregationsvorgänge als Reaktionen höherer Ordnung begünstigt werden.
  • 3. Die Renaturierung sollte bei niedriger Temperatur (ca. 4-10 °C) durchgeführt werden um die Aggregation zu unterdrücken.
  • 4. Aggregation kann durch löslichkeitsvermittelnde Zusätze wie L-Arginin reduziert werden.
  • 5. Bei disulfidverbrückten Proteinen muss dem Rückfaltungsansatz ein Redoxsystem zugefügt werden.

Punkt 5 soll hier noch näher beleuchtet werden. Prinzipiell könnte eine Oxidation von Cysteinresten durch Einbringen von Luftsauerstoff erhalten werden. Dennoch werden hohe Ausbeuten an korrekt disulfidverbrückten Proteinen fast immer nur durch den Einsatz eines Redoxsystems, bestehend aus einer oxidierenden und einer reduzierenden Komponente, erreicht. Häufige Anwendung finden Gemische aus reduziertem und oxidiertem Glutathion bzw. Cystein/Cystin. Die Anwesenheit der reduzierenden Komponente bewirkt, dass falsch verknüpfte Disulfidbrücken wieder reduziert und durch die oxidierende Substanz re-oxidiert, also korrigiert werden können. Durch dieses ­redox-shuffling von Disulfidbrücken wird der Anteil an nativen Verbrückungen erhöht.

Reinigung der Proteine
Nach der Renaturierung werden die löslichkeitsvermittelnden Substanzen durch Dia­lyse beseitigt. Bei diesem Schritt fallen viele nicht korrekt gefaltete Spezies aufgrund einer Exposition hydrophober Oberflächen und damit hohen Aggregationsanfälligkeit aus. Dadurch kann ein Großteil der nicht nativen Proteine durch Zentrifugation entfernt werden, die native Spezies wird dagegen angereichert. Allerdings können auch fehlgefaltete Strukturen in löslicher Form vorliegen. Deshalb muss in jedem Fall eine Reinigung der nativen Spezies durch konventionelle Chromatographie-Schritte durchgeführt werden. Meistens werden zwei Chromatographie-Schritte wie Ionenaustausch- oder Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie gewählt, um natives Protein in homogener Konformation zu erhalten. Reinigungen mittels endständiger tags, wie beispielsweise dem Histidin-tag, sind sinnlos, da diese Affinitäts-Chromatographie auf einer tag-vermittelten Bindung beruht. Vielmehr muss die Reinigung die spezifischen Eigenschaften des nativen Proteins, also dessen intrinsische biochemische Parameter wie Ladung, Hydrophobizität, Größe, etc. nutzen. Ein Beispiel der Reinigung eines humanen Knochenwachstumsfaktors nach Renaturierung aus IBs ist in Abbildung 2 gezeigt.

Nach Vorliegen des nativen Proteins in homogener Form finden die entsprechenden Tests auf Funktionalität statt, die mit biophysikalischen Analysen kombiniert werden können. Da Proteine für die Diagnostik und Therapie entweder enzymatische Aktivität besitzen oder an Zielstrukturen binden (z.B. Antikörper), sind Funktionalitätstests für die Proteine meistens bereits etabliert.

Referenzen
[1] Rudolph R. et al.: In Protein Function: A Practical Approach (Creighton, T.E., Hrsg.) S. 57-99, Oxford University Press, Oxford. (1997)

Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/GIT-Biotechnologie
Mehr Informationen zu Glykoproteinen: http://bit.ly/Glykoproteine

 

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