Sensoren in der Veterinärdiagnostik

Kostendruck als treibende Kraft für Innovation

  • Abb. 1: Prinzip von RIfS und 1λ-RIfS. Während bei RIfS die Verschiebung des Interferenzspektrums verfolgt wird, wird bei 1-λ-RIfS die Information aus der Intensitätsänderung des reflektierten Lichts bei einer Wellenlänge entnommen.Abb. 1: Prinzip von RIfS und 1λ-RIfS. Während bei RIfS die Verschiebung des Interferenzspektrums verfolgt wird, wird bei 1-λ-RIfS die Information aus der Intensitätsänderung des reflektierten Lichts bei einer Wellenlänge entnommen.
  • Abb. 1: Prinzip von RIfS und 1λ-RIfS. Während bei RIfS die Verschiebung des Interferenzspektrums verfolgt wird, wird bei 1-λ-RIfS die Information aus der Intensitätsänderung des reflektierten Lichts bei einer Wellenlänge entnommen.
  • Abb. 2: Arbeitsschritte bei RIfS: 1. Oberfläche, beschichtet mit der Erkennungsstruktur- 2. Zugabe der Analytlösung. Bei der Durchführung eines ELISA sind die Arbeitsschritte 3 und 4 zusätzlich erforderlich: 3. Zugabe einer sekundären Erkennungsstruktur mit gekoppeltem Enzym- 4. Zugabe eines Substrats, Umwandlung in ein farbiges Produkt, photometrische Auslesung.
  • Abb. 3: Darstellung des erhaltenen Messsignals am CRP-Antikörper-Spot für vier nacheinander gemessene Proben mit CRP und Salmonellenantikörpern in den Konzentrationen 5 mg/L, 10 mg/L, 20 mg/L und 40 mg/L.

Gerade für kleine und mittlere Unternehmen, die im Bereich von Tests und Sensoren für diagnostische Anwendungen tätig sind, ist die Veterinärdiagnostik ein attraktiver Zwischenschritt auf dem Weg zu humandiagnostischen Anwendungen. Die Auflagen im Zulassungsverfahren sind einfacher zu erfüllen und damit die Vorlaufzeiten deutlich verkürzt. Ein entscheidender Punkt in der Veterinärdiagnostik ist der hohe Kostendruck. Im Rahmen des von der AIF geförderten Projektes „Optische Tierdiagnostik“ wurde ein tragbares, optisches Sensorsystem basierend auf RIfS [1] entwickelt, das aus kommerziellen Komponenten für unter 1000 € realisierbar ist. Es ermöglicht die kostengünstige, schnelle und parallele Detektion mehrerer Infektionen vor Ort.

Tragbare Diagnosesysteme sind sehr wünschenswert für die Humandiagnostik, das Schlagwort point-of-care ist derzeit in aller Munde. Doch auch in der Veterinärdiagnostik ist ein schnelles, vor Ort erzeugtes Ergebnis ein klarer Vorteil, um schnellstmöglich auf Krankheiten in Tierbeständen reagieren zu können. Solche Systeme müssen einfach zu Bedienen sein, damit auch Tierärzte ohne spezielle Laborausbildung die Tests durchführen können. Das parallele Testen mehrerer, verwandter Krankheitsparameter ist in der Humandiagnostik für Differentialdiagnosen gut etabliert, doch auch in der Veterinärdiagnostik ist ein Trend in Richtung von Messungen mit höherem Informationsgehalt abzusehen.

Ein wesentlicher Unterschied liegt in dem deutlich höheren Kostendruck in der Veterinärdiagnostik, insbesondere wenn es sich um Tests bei Nutztieren handelt. Um auf dem Markt gut positioniert zu sein, wäre es wünschenswert, dass die Kosten für den Test eines Parameters pro Tier einen Euro nicht überschreiten. Das macht eine drastische Reduktion der Kosten im Bereich der Verbrauchsmaterialien nötig. Bei markierungsfreien Testverfahren wie der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) kann auf die Zumischung von teuren, markierten Reagenzien verzichtet werden. Außerdem lassen sich RIfS-Sensoren mit relativ einfachen, kommerziell verfügbaren Komponenten realisieren. Somit können auch die Investitionskosten für die Hardware reduziert werden.

Entwicklung des Sensorsystems
RIfS basiert auf der Interferenz von Weißlicht an dünnen Schichten, die auf ein Glassubstrat aufgebracht sind.

In Abhängigkeit von Schichtdicke und Brechungsindex werden manche Wellenlängen verstärkt und andere ausgelöscht. Durch Anlagerung von Molekülen wie beispielsweise Antikörpern kommt es bei RIfS zur Verschiebung dieser charakteristischen Wellenlängen, wodurch diese Anlagerung zeitaufgelöst verfolgt und quantifiziert werden kann. Eine Weiterentwicklung von RIfS nutzt nur die Änderung der Intensität einer Wellenlänge, um derartige Anlagerungen zu verfolgen (1-λ-RIfS) (Abb. 1). Damit sind deutlich einfachere Detektionssysteme möglich, die eine LED als Lichtquelle und eine einfache Photodiode als Detektor nutzen. Die Firma Qiagen vertreibt ähnlich einfach aufgebaute Detektionsmodule für Fluoreszenzmessungen, die dafür optimiert sind, über eine konfokale Optik ein kleines Volumen der Probe mit Licht einer Wellenlänge anzuregen und das emittierte Licht zu detektieren. Durch einen einfachen Austausch der Filter ist es möglich, diesen Aufbau für 1-λ-RIfS zu nutzen, wobei der Focus auf die Sensoroberfläche gerichtet wird. Montiert wird der Transducer auf einer positionierbaren Schiene, so dass an verschiedenen Stellen der Sensoroberfläche gemessen werden kann. Durch ortsaufgelöste Anbindung hochselektiver Erkennungsstrukturen ist es somit möglich, aus einer Probe mehrere diagnostische Parameter simultan zu bestimmen.

Die Kombination des Detektors mit einer Fluidik und Software zur Ansteuerung ermöglicht gut reproduzierbare Messergebnisse. Eine Vereinfachung der Ansteuerung für die Nutzung durch Personen ohne spezielle Laborausbildung ist ohne weiteres möglich. Eine Diagnose kann mit dem System meist schon nach wenigen Minuten vor Ort gestellt werden.

Testentwicklung
Als Alternative zum „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) [2] wurde ein direktes Testformat angestrebt. Dabei wird lediglich eine mit der Erkennungsstruktur beschichtete Oberfläche benötigt, über die der Analyt im Fluss befördert wird (Abb. 2). Durch die zeitaufgelöste Detektion mittels RIfS kann über die Auswertung der Signalsteigung oder alternativ der absoluten Signaländerung innerhalb weniger Minuten auf die Analytmenge zurück geschlossen werden.

Damit sichergestellt werden kann, dass ausschließlich der Analyt mit der Erkennungsstruktur auf der Oberfläche wechselwirkt, wird die Sensoroberfläche chemisch so modifiziert, dass unspezifische Wechselwirkungen wie etwa mit Matrixbestandteilen aus der Analytlösung unterdrückt werden. Hierfür hat sich der Einsatz von (Bio)polymeren wie Polyethylenglycol oder Aminodextran bewährt [3]. Diese bieten darüber hinaus die Möglichkeit, die entsprechende Erkennungsstruktur über funktionelle Gruppen auf die sensitive Schicht zu immobilisieren. Diese Anbindung kann kovalent erfolgen, über hydrophobe Wechselwirkung zwischen der Erkennungsstruktur und der Sensoroberfläche oder über hochaffine Wechselwirkungen wie etwa zwischen Streptavidin und Biotin [4]. Durch den modularen Aufbau der sensitiven Schicht ist somit eine Vielzahl von Variationen gegeben, wie eine Erkennungsstruktur auf die Sensoroberfläche aufgebracht werden kann. Die Immobilisierungsvariante, welche sich als am geeignetsten bei der Etablierung des Einzelassays erweist, wird in der Regel verwendet. Im Rahmen des Projektes wurden unter anderem Assays für den Nachweis von Salmonellen- und Chlamydieninfektionen sowie für den Entzündungsmarker C-reaktives Protein (CRP) entwickelt. Für den Nachweis der Infektionen (Antikörpernachweis) wurde das jeweilige Antigen, ein Lipopolysaccharid, als Erkennungsstruktur über hydrophobe Wechselwirkung auf der Sensoroberfläche immobilisiert. Im Gegensatz dazu wurden für den Nachweis von CRP entsprechende Antikörper kovalent als Erkennungsstruktur auf der Sensoroberfläche angebunden.

Nach der Etablierung der Assays in Puffer wurde überprüft, ob diese auch in komplexen Matrizes angewendet werden können. Hierfür wurde als Modellmatrix für Realseren fetales Kälberserum (fetal calf serum, FCS) eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass RIfS auch in dieser komplexen Matrix eingesetzt werden kann.

Sollen mehrere Parameter parallel aus einer Analytlösung bestimmt werden, so müssen die zuvor etablierten Einzelassays auf einem Sensorchip vereint werden. Beispielsweise kann bei der Bestimmung von Salmonelleninfektionen die Quantifizierung von CRP zu ergänzenden Informationen über das Stadium der Infektion führen. Für den parallelen Nachweis von Salmonelleninfektionen und CRP wurden die jeweiligen Assaybedingungen harmonisiert und auf mögliche Kreuzreaktivitäten getestet. Es konnte erfolgreich demonstriert werden, dass beide Parameter gleichzeitig quantifiziert werden können (Abb. 3).

Zusammenfassung
Das Sensorsystem orientiert sich stark an den Anforderungen für die Veterinärdiagnostik und ist durch die kommerziell verfügbaren Komponenten leicht durch KMUs zur Produktreife weiterzuentwickeln. Die einzelnen Komponenten lassen sich auch mit relativ geringem Aufwand in bestehende Plattformen integrieren. Durch den modularen Aufbau der Sensorbeschichtung können leicht neue Anwendungsbereiche erschlossen werden, die Vorarbeiten bezüglich der Harmonisierung von Beschichtungs- und Testverfahren werden dabei nützlich sein.

Danksagung
Das IGF-Vorhaben (16061 N/1) der Forschungsgesellschaft für Messund Sensortechnik e.V., Dresden wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung und –entwicklung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Auf Anfrage kann eine Kopie des Abschlussberichts zur Verfügung gestellt werden.

Literatur
[1] Proll G. et al.: Reflec. Interf. Spectr. Biosen. and Biodetec., Humana Press. 503, 167–178 (2009)
[2] Wyatt G. M. et al.: Food and Agricultural Immunology 7, 345–350, (1995)
[3] Piehler J. et al.: Biosensors and Bioelectronics 11, 579–590, (1996)
[4] Le Blanc A. F. et al.: GIT Labor-Fachzeitschrift 54(2), 90–93, 2010

Autoren
Dipl. Chem. Melanie Ewald, Dipl. Biochem. Alexander Fabian Le Blanc, Prof. Dr. rer. nat. Günter Gauglitz, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie (IPTC), Eberhard Karls Universität Tübingen

 

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