Verfahren zum Nachweis von Sepsis: Früh erkannt, Gefahr gebannt

  • Viele Gram-negative Stäbchen können Sepsis auslösen. Vielfältige Antibiotikaresistenzen machen diese Bakterien zunehmend schwer bekämpfbar. © sebastian kaulitzki - fotoliaViele Gram-negative Stäbchen können Sepsis auslösen. Vielfältige Antibiotikaresistenzen machen diese Bakterien zunehmend schwer bekämpfbar. © sebastian kaulitzki - fotolia
  • Viele Gram-negative Stäbchen können Sepsis auslösen. Vielfältige Antibiotikaresistenzen machen diese Bakterien zunehmend schwer bekämpfbar. © sebastian kaulitzki - fotolia
  • Abb. 1: Petrischale mit Bakterienkulturen (Escherichia sp.): Bakterien dieses Typs sind weit verbreitete Pathogene. © Claudia Disqué
  • Abb. 2: PCR-test für die Detektion von Sepsis verursachenden (Molzym, SepsiTest) © Claudia Disqué
  • Abb. 3: MinoLab-System, Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI
  • Tab. 1: Übersicht über kommerziell erhältliche Sepsisdiagnoselösungen (Auswahl).

Sepsis ist eine systemische Entzündungsreaktion, die bei Nicht- oder Falschbehandlung in kürzester Zeit zum Tod führen kann. Ursache ist eine Infektion mit Krankheitserregern, die häufig mit unspezifischen Symptomen wie Fieber oder veränderter Herzfrequenz beginnen kann. Klassisch wird eine Sepsis seit vielen Jahrzehnten mit Hilfe einer Blutkultur nachgewiesen, eine etablierte Methode, die jedoch bis zu mehreren Tagen in Anspruch nehmen kann.

Um Betroffenen effektiver mit gezielten Therapien helfen zu können, sind dringend Verfahren zur Aufklärung über die Art des Erregers gefordert. Hier wollen wir verschiedene Methoden zur schnellen Sepsisdiagnostik vorstellen, die sich bereits am Markt oder in der Entwicklung befinden. Der Fokus liegt auf Produkte, die den direkten Nachweis der Erreger aus Vollblut ermöglichen. Die Blutvergiftung gilt als eine der häufigsten Todesursachen weltweit.

Allein in Deutschland sterben rund 60.000 Menschen an dieser Erkrankung, wobei die öffentliche Wahrnehmung dieser Entzündungsreaktion im Vergleich zu Herz-Kreislauf- oder Krebserkrankungen immer noch sehr gering ist [1]. Und das, obwohl die Überlebenswahrscheinlichkeit bei Betroffenen nach Angaben des Kompetenznetzes Sepsis bei lediglich 40–60 % liegt [2]. Eine der Ursachen für die hohe Sterblichkeitsrate liegt in der falschen Behandlung bedingt durch die späte Diagnose.

Sepsistherapie im Blindflug

Im Verdachtsfall einer Sepsis behandelt der Arzt Patienten entsprechend einer Leitlinie der Deutschen Sepsis-Gesellschaft [3], initial jedoch weitestgehend im Blindflug, da dem Arzt meist Informationen zum Krankheitserreger fehlen. Jeder einzelne Mikroorganismus, sei des Bakterium, Pilz oder Virus, erfordert eine auf ihn abgestimmte Behandlungsstrategie, um das Leben des Betroffenen zu retten. Im klassischen Fall der Diagnostik ermöglicht jedoch erst eine mikrobiologische Kultivierung definierte Aussagen über den Erreger (Abb.1).

Obwohl ein diagnostisches Ergebnis erst nach 18 Stunden bis zu mehreren Tagen vorliegt, beginnt der Mediziner trotzdem sofort mit einer „empirischen“ Antibiotikatherapie. Ein breites Spektrum an Mikroorganismen soll abgetötet und der Infektionsherd (falls überhaupt bekannt) beseitigt werden.

Verschiedene Methoden, wie die Bestimmung des Gehalts des Biomarkers Procalcitonin (PCT) [4] im Serum, unterstützen hier, da sie als Hilfsmittel zur Feststellung einer Sepsis und zur Kontrolle der Antibiotikagabe dienen können. Ebenso kann so die Wirkung einer Antibiotikagabe kontrolliert werden.

Aussagen über die Art des Erregers und eventuell vorliegende Antibiotika-Resistenzen gibt es jedoch beim Einleiten der Therapie nicht. An dieser Stelle setzen Produkte verschiedener Diagnostikunternehmen sowie erfolgversprechende Neuentwicklungen an (siehe Auswahl in Tab. 1). Mit dem Ziel, eine schnellere und maßgeschneiderte Therapie zu ermöglichen, sollen so Mediziner in der Wahl ihrer Mittel unterstützt werden. Die Tabelle fokussiert auf bereits CE-zertifizierte, kommerziell erhältliche molekularbiologische Tests zur Sepsisdiagnostik ergänzt durch Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time Of Flight Massenspektrometrie (MALDITOF)- Verfahren.

Der Schnelltest Septifast von Roche ist in der Lage, 25 Organismen (Bakterien und Pilze) parallel über eine Realtime-Polymerase Kettenreaktion (PCR) nachzuweisen. Dieser Test kann rund 90% der sepsisrelevanten Pathogene charakterisieren. Der Anwender benötigt 1,5 ml Vollblut, wobei initial eine Isolation der gesamten DNA mit Hilfe keramischer Beads durchgeführt wird. Nach einer manuellen Aufreinigung über säulenchromatrographische Verfahren erfolgt die Überführung der isolierten DNA in das hauseigene Realtime-PCRGerät.

Optimal erfolgt die Analyse in weniger als 6 Stunden, wobei der reale Zeitbedarf wesentlich auch von der Integration in den organisatorischen Klinikablauf abhängen kann. In den letzten Jahren sind viele Studien durchgeführt worden, die Stärken und Schwächen des Tests beschreiben. Das Detektionslimit ist im Vergleich zur Blutkultur, die theoretisch einen einzigen kultivierbaren pathogenen Keim pro Milliliter Blut nachweisen kann, etwas höher. Außerdem werden auch bereits antibiotisch abgetötete Keime über die PCR nachgewiesen, die mittels Blutkultur kein Ergebnis geben würden [9].

Abreicherung humaner Nukleinsäure

Größere Mengen an Patientenblut könnten helfen, die Sensitivität der diagnostischen Tests zu verbessern. Doch was tun mit dem großen Überschuss an humaner DNA, die parallel zur Pathogen-DNA aufgereinigt wird? Um die Störeinflüsse humaner Nukleinsäure zu verringern, haben Unternehmen clevere Lösungen erarbeitet. Molzym reduziert die humane DNA mit ihrem Produkt SepsiTest (Abb.2) durch eine sequentielle Lyse [8].

Vor der eigentlichen Freisetzung der Nukleinsäure der Erreger werden Blutzellen lysiert und die humane DNA enzymatisch abgebaut. Nach Anreicherung der intakten Bakterien oder Pilze erfolgt ein gezieltes Aufbrechen dieser Zellen. Die spezifischen 16S rDNA-Abschnitte der Keime können so weitestgehend ohne Störeinfluss humaner DNA vervielfältigt werden. Eine ähnliche Lösung bietet die Jenaer Firma SIRS-Lab, die das unterschiedliche Methylierungsmuster pround eukaryotischer Nukleinsäuren ausnutzt.

Ein rund 20-facher Überschuss an Cytosin-Guanosin- Dinukleotiden (CpG-Motive) in prokaryotischer Nukleinsäure, die nicht-methyliert vorliegen, dient als Unterscheidungsmerkmal. Das Unternehmen verwendet eine affinitätschromatographische Aufreinigung in seinem Produkt VYOO. Hierbei bindet ein funktionelles Protein gezielt die pathogenen CpG-Motive. Eine bis zu 90 %ige Abreicherung von eukarotischer Nukleinsäure verbessert das analytische Ergebnis deutlich.

Massenspektrometrische Verfahren

Unternehmen wie Bruker Daltonik (SepsiTyper) [12, 13] oder Abbott (Ibis Bioscience) [11] setzen auf MALDI-TOF als eine mögliche Applikation zur Sepsisdiagnostik. In klinischer Erprobung befinden sich Ansätze, die aus positiven Blutkulturen heraus eine schnelle Charakterisierung der pathogenen Organismen ermöglichen. Auch eine Kopplung einer (broad-range)-PCR mit MS-Technologien liefert vielversprechende Ergebnisse, die in Zukunft einiges erwarten lassen.

Aktuelle Projekte aus Forschung und Entwicklung

Zwei spannende und innovative Forschungsansätze seien beschrieben, um die Produktpipeline zur Sepsisdiagnositk abzubilden. Fast- Diagnosis [14] ist ein vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördertes Projekt klinischer Gruppen aus Jena und Dresden sowie der Firmen Qiagen, rap.ID und RBiopharm. Ziel des Konsortiums ist ein diagnostischer Ansatz aus drei aufeinander aufbauenden Schritten.

Nur einige Minuten dauert die initiale Multiplex-Charakterisierung von Entzündungsmarkern auf Basis eines lateral flow Teststreifens. Das Ergebnis, der sog. Sepsis-Score, spiegelt die Wahrscheinlichkeit einer Sepsiserkrankung wider. Im zweiten Schritt werden die Erreger mittels Mikro-Raman- Spektroskopie [15] identifiziert. Falls notwendig erfolgt der dritte und abschließende Schritt des Projekts, eine ca. 2-stündige isothermale Amplifikation bestätigt die Erreger und ermittelt eventuell vorliegende Antibiotikaresistenzen.

Integriertes Labor im Hosentaschenformat

Beim MinoLab-System muss der Mediziner lediglich die zu untersuchende Probe in ein kleines Gerät stecken. Entwickelt wird das hochintegrierte „Lab-on-a-chip“-Produkt derzeit im gleichnamigen BMBF-geförderten Projekt [16] vom Fraunhofer- Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI (Leipzig) in deutsch-österreichischer Kooperation mit dem Austrian Institute of Technology, Fraunhofer IZM, Magna Diagnostics, Siemens, Intel und microfluidic ChipShop.

Das Verfahren nutzt magnetische Partikel, die über spezifische Fängermoleküle an pathogenen Zellen in einer Blutprobe binden und das Lab-on-a-chip-System vollautomatisch per Magnetkraft durchlaufen. Diese Fängermoleküle sind für die Funktionalität des Systems von entscheidender Bedeutung. Antikörper oder auch kurze Peptidsequenzen werden eingesetzt, um die geringe Menge pathogener Keime zu isolieren.

Über einen Magneten werden die Partikel samt Krankheitserreger auf eine Kunststoffkarte überführt und durch verschiedene miniaturisierte Reaktionskammern bewegt (Abb.3). Dort erfolgt neben der Lyse der Erregerzellen eine PCR an der Oberfläche speziell präparierter Nanopartikel. Auf der Oberfläche dieser Magnetbeads befinden sich immobilisierte Primer, DNASequenzen, die jeweils charakteristisch für eine Pathogensequenz sind.

Auf einem magnetoresistiven Biochip werden die Produkte der an die Magnetobeads gebundenen PCR über Hybridisierungssonden gezielt detektiert. So soll der Mediziner nach 1–2 Stunden diagnostische Aussagen über Krankheitserreger sowie Antibiotikaresistenzen erhalten. Von der magnetischen Isolation der Pathogene, dem Transport auf dem Lab-on-chip-System über die Bead-gebundene PCR bis zum Einsatz als Label zur Detektion wird bei diesem Verfahren die Vielseitigkeit der magnetischen Nanopartikel ausgenutzt.

Sämtliche Reaktionen, von der Probenaufbereitung über die Zielmolekülisolation bis zum Nachweis, können dabei berührungsfrei und vollautomatisch erfolgen. Bis dieses Gerät zur klinischen Erprobung zur Verfügung stehen wird, werden allerdings noch einige Jahre vergehen. Zusammenfassend bieten die bereits erhältlichen Produkte und vielversprechenden Entwicklungen eine sinnvolle Ergänzung zu den etablierten Blutkulturen und Biomarker-Tests.

Erste Studien zeigten [17], dass die Kombination von herkömmlichen mit neuen, sensitiven Methoden durchaus in der Lage sein können, den Behandlungserfolg und damit die Überlebenswahrscheinlichkeit der betroffenen Personen deutlich zu verbessern. Ein Ergebnis, dass höhere Kosten mehr als kompensieren sollte.

Literatur

[1] Reinhard K. und Brunkhorst FM. Med. Welt. 58, 3–32 (2007)

[2] http://www.kompetenznetz-sepsis.de/

[3] Reinhart K. et al.: Anaesthesist. 59(4):347–70 (2010)

[4] Reinhart K. und Meisner M. Crit Care Clin. 27(2):253–63 (2011)

[5] Ecker DJ. et al.: Expert Rev Mol Diagn. 10(4): 399–415 (2010)

[6] Yanagihara K. et al.: Crit Care. 14(4): R159 (2010)

[7] Dierkes C. et al.: BMC Infect Dis. 11;9: 126 (2009)

[8] Mühl H. et al.: Diagn Microbiol Infect Dis. 66(1):41–9 (2010)

[9] Mancini N. et al.: Clin Microbiol Rev. 23(1): 235–51 (2010)

[10] Hansen WL. Bruggeman CA, Wolffs PF. J Clin Microbiol.; 47(8):2629–31 (2009)

Weitere Literatur ist beim Autoren erhältlich.

Autor(en)

Kontaktieren

Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI
Perlickstraße 1
04103 Leipzig
Germany
Telefon: +49 341 35536-1000
Telefax: +49 341 35536-8-1000

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.