Zielgerichtete Chemotherapie: Zytotoxische Biokonjugate

  • Abb. 1. Schematische Darstellung der Aufnahme eines Biokonjugats in GnRH-Rezeptor-positiven und -negative Zellen. Durch die GnRH-Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Biokonjugats werden nur GnRH-Rezeptor-positive Zellen geschädigt.Abb. 1. Schematische Darstellung der Aufnahme eines Biokonjugats in GnRH-Rezeptor-positiven und -negative Zellen. Durch die GnRH-Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Biokonjugats werden nur GnRH-Rezeptor-positive Zellen geschädigt.
  • Abb. 1. Schematische Darstellung der Aufnahme eines Biokonjugats in GnRH-Rezeptor-positiven und -negative Zellen. Durch die GnRH-Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Biokonjugats werden nur GnRH-Rezeptor-positive Zellen geschädigt.
  • Abb. 2. Schematische Darstellung von AN-152.
  • Abb. 3. Schematische Darstellung eines Daunorubicin-GnRH-III Biokonjugats mit Oximbindung.

Die Chemotherapie ist immer noch die am häufigsten angewendete Behandlungsstrategie gegen Krebs; insbesondere bei Krebsformen im Spätstadium, metastasierenden Tumoren und Leukämie ist Chemotherapie meist die einzige Therapiemöglichkeit.

Zur Behandlung von Krebs durch Chemotherapie werden verschiedene Medikamente, die sogenannten Zytostatika oder Chemotherapeutika, eingesetzt. Leider schaden diese Substanzen nicht nur den Krebszellen, sondern auch den gesunden, sich-schnell-teilenden, Zellen. Daher ist die Verabreichung der Zytostatika mit vielen Nebenwirkungen, wie z. B. Haarausfall, Übelkeit und Blutbildveränderungen, verbunden.

Neue Wege
Deswegen ist die Entwicklung neuer Therapieansätze für eine sicherere Behandlung von Krebs von großem Interesse. Das Ziel dieser neuen Strategien ist es, die Wirkung und Verträglichkeit bereits in der Klink etablierter Chemotherapeutika zu verbessern. Eine dieser Strategien ist die sogennante zielgerichtete Chemotherapie (engl. „targeted cancer chemotherapy"), eine Therapie, die nur bösartige Zellen angreift und gesunde Zellen verschont. Dadurch werden die Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Wirkstoffen vermieden. Für die zielgerichtete Chemotherapie werden Zielmoleküle auf der Zelloberfläche benötigt, die vornehmlich auf Krebszellen exprimiert werden.

Gonadotropin-Releasing Hormon
Ein Beispiel für solche Zielmoleküle sind die Rezeptoren für das Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH), die auf der Zelloberfläche vieler verschiedener Krebstypen vermehrt vorkommen. Auf den entsprechenden gesunden Geweben werden sie jedoch kaum exprimiert. GnRH ist ein im Hypothalamus gebildetes Hormon, das eine sehr wichtige Rolle in der Kontrolle der Reproduktion spielt. Es stimuliert die Synthese und Sekretion der gonadotropen Hormone der Adenohypophyse und dadurch die Sekretion von Sexsteroiden. Da das GnRH-Peptid und seine Analoga mit hoher Affinität an GnRH-Rezeptoren auf Krebszellen binden, können sie als Trägermoleküle (engl. „targeting moieties") für Zytostatika verwendet werden. Durch die Rezeptor-vermittelte Aufnahme des Hybridwirkstoffs aus GnRH und Zytostatikum, eines sogenannten Biokonjugats, werden nur Zellen, die den GnRH-Rezeptor exprimieren, geschädigt.

Die Zellen, die keine Rezeptoren exprimieren, nehmen das Biokonjugat nicht auf und werden verschont (Abb. 1). Desweiteren führt die Spezifität dieser zytotoxischen Biokonjugate zu einer höheren Konzentration des Zytostatikums im Tumor; dadurch wird die Effizienz der Chemotherapie verbessert, während die Nebenwirkungen minimiert werden.

Zytotoxische GnRH Biokonjugate
Die ersten zytotoxischen Biokonjugate wurden in den späten 1980er Jahren in der Arbeitsgruppe von Professor Andrew V. Schally in den USA entwickelt. Das vielversprechendste Biokonjugat war AN-152, bestehend aus dem Wirkstoff Doxorubicin, einem Glutarsäure-Linker und dem Trägermolekül [D-Lys6]-GnRH (Abb. 2). Es konnte gezeigt werden, dass dieses Biokonjugat eine signifikante zytotoxische Wirkung auf verschiedene GnRH-Rezeptor-positive Tumortypen hat. Darüber hinaus war das Biokonjugat weniger toxisch als äquimolare Mengen freien Doxorubicins [1,2]. Die GnRH-Rezeptor-vermittelte Aufnahme von AN-152 in GnRH-Rezeptor-positive Krebszellen konnte durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bewiesen werden. Es konnte keine Aufnahme in GnRH-Rezeptor-negative Zellen, sowie nach Blockade der GnRH-Rezeptoren in GnRH-Rezeptor-positiven Zellen beobachtet werden. In den Krebszellen, wird das Biokonjugat nach seiner Internalisierung intrazellulär abgebaut (die Esterbindung zwischen Doxorubicin und dem Glutarsäure-Linker wird durch Carboxylesterasen abgespalten) und der Wirkstoff Doxorubicin freigesetzt. Danach gelangt das freigesetzte Doxorubicin in den Zellkern, wo es in die DNA interkaliert und dadurch Apoptose auslöst [3]. Aufgrund der vielversprechenden präklinischen Ergebnisse wurden bereits klinische Studien mit AN-152 bei Frauen mit gynäkologischen Krebserkrankungen (z. B. Ovarial- und Endometriumkarzinom) durchgeführt; die bis jetzt erhaltenen Ergebnisse zeigten sowohl eine Antikrebswirkung, als auch eine gute Verträglichkeit mit wenigen Nebenwirkungen [4].

Nicht humane GnRH
Neben der Anwendung von humanen GnRH und seinen Analoga als Tragermoleküle für die GnRH-Rezeptor-vermittelte Chemotherapie, fokussiert sich die aktuelle Forschung auf die Entwicklung von GnRH-Derivaten mit einer niedrigeren endokrinen Wirkung und einer erhöhten Antikrebswirkung. Daher wurde in unserer Arbeit ein anderes GnRH Analog als zielgerichtetes Molekül verwendet, das aus dem Meerneunauge (Petromyzon marinus) isolierte Gonadotropin-Releasing Hormon-III (GnRH-III). Es konnte gezeigt werden, dass GnRH-III an GnRH-Rezeptoren auf der Oberfläche von Krebszellen bindet, während es jedoch eine niedrigere endokrine Wirkung als das humane Hormon besitzt [5]. Desweiteren hat GnRH-III selbst einen antiproliferativen Effekt auf Krebszellen [6]. Diese Eigenschaften unterstreichen die Vorteile von GnRH-III als Trägermolekül für die zielgerichtete Chemotherapie.

Zytotoxische GnRH-III Biokonjugate
Um zielgerichtete Chemotherapeutika zu entwickeln, wurden verschiedene Wirkstoffe für die Krebstherapie (z. B. Daunorubicin, Doxorubicin, Methotrexat) an das GnRH-III Molekül und dessen Derivate gekoppelt (Abb. 3). Entscheidend für die Wirksamkeit solcher Biokonjugate sind verschiedene Faktoren wie z. B. die Art des Zytostatikums, die chemische Modifizierungen des GnRH-III Peptids, die chemische Bindung zwischen GnRH-III und Zytostatikum, sowie deren chemische und enzymatische Stabilität, u. a. in humanem Serum, in lysosomalen Präparaten und in Anwesenheit verschiedener Verdauungsenzyme. Die Wirkstoffe müssen beispielsweise im Blutkreislauf stabil sein, um nach einer intravenösen Gabe die frühzeitige Abspaltung des Zytostatikums und damit starke Nebenwirkungen zu verhindern. Nach der Bindung an die GnRH Rezeptoren sollten die Biokonjugate in die Zellen aufgenommen und danach in den Lysosomen weiter abgebaut werden. Verschiedene Biokonjugate wurden bereits durch eine Kombination von Festphasenpeptidsynthese und Flüssigphasen Chemie hergestellt. Diese neuen Verbindungen beinhalten verschiedene Zytostatika, wie z. B. Doxorubicin und Daunorubicin, die durch verschiedene chemische Bindungen (Oxim-, Hydrazon-, Amid- oder Esterbindung) an GnRH-III Analoga gekoppelt wurden [7-9].

Analytik
Nach der Synthese wurden die Biokonjugate durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt und massenspektrometrisch analysiert. Die Reinheit und molekulare Beschaffenheit der Biokonjugate sind besonders wichtige Eigenschaften für eine korrekte Bestimmung der Antikrebswirkung. Der Einfluss verschiedenener GnRH-III Analoga, der Natur der chemischen Bindung zwischen dem Wirkstoff und dem GnRH-III sowie unterschiedlicher Zytostatika auf die in vitro Stabilität / Abspaltung und Zellaufnahme, sowie die Antikrebswirkung dieser Biokonjugate wurden untersucht. Mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass die synthetisierten Biokonjugate von verschiedenen Krebszellen aufgenommen werden. Die zytostatische Aktivität der Wirkstoffe wurde bereits an humanen Krebszelllinien, wie z.B. MCF-7 Brust-, HT-29 Darm- und LNCaP Prostatakrebszellen nachgewiesen. Im Gegensatz zu dem Daunorubicin-Biokonjugat mit Amidbindung, das keine Antikrebswirkung besitzt [10], zeigten alle anderen Biokonjugate einen in vitro zytostatischen Effekt auf Brust-, Darm- und Prostatakrebszellen. Durch massenspektrometrische Analyse konnte festgestellt werden, dass die Biokonjugate, die eine Oximbindung enthalten (Abb. 3), die höchste Stabilität in humanem Serum besitzen. Darüber hinaus wurde die Stabilität der Biokonjugate in einem lysosomalen Präparat untersucht, und verschiedene Abbauprodukte, die für die Antikrebswirkung der Biokonjugate eine wichtige Rolle spielen, konnten identifiziert werden. Die Spezifität und Wirksamkeit dieser chemotherapeutischen Daunorubicin-GnRH-III Biokonjugate, die eine Oximbindung enthalten, konnte bereits durch Versuche an Mäusen, die z.B. ein Darmkarzinom tragen, gezeigt werden. Nach der Verabreichung der Biokonjugate konnte eine bis zu 50 %ige Inhibierung des Tumorwachstums beobachtet werden. Im Gegensatz zu freien Daunorubicin zeigten diese Verbindungen keine Toxizität an gesunden Mäusen [11].

Fazit
Eine mögliche Strategie, um die Wirksamkeit der Biokonjugate zu erhöhen, ist die Entwicklung von Wirkstoffen, die mehr als ein Zytostatikum enthalten. Diese multifunktionelle Biokonjugate könnten die therapeutische Effizienz deutlich erhöhen. Solche komplexen Verbindungen, die zwei identische (z. B. Daunorubicin) oder verschiedene Chemotherapeutika enthalten (z. B. Daunorubicin und Methotrexat) wurden bereits in unserer Arbeitsgruppe synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu den monofunktionellen Wirkstoffen, die nur ein Chemotherapeutikum enthalten, ihre in vitro Antikrebswirkung auf Brust-, Darm- und Prostatakrebszellen erhöht ist [12,13]. Die bisher vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die GnRH-Rezeptor-vermittelte Chemotherapie ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von Krebs darstellt.

Literatur
[1] Nagy A. et al.: Proc Natl Acad Sci USA. 93(14):7269-7273 (1996)
[2] Schally A.V. and Nagy, A. Eur J Endocrinol. 141(1):1-14 (1999)
[3] Westphalen S. et al.: Int J Oncol. 17(5):1063-1069 (2000)
[4] Engel J. et al.: Expert Opin Investig Drugs. 21(6):891-899 (2012)
[5] Kovács M. et al.: Peptides. 28(4):821-829 (2007)
[6] Lovas S. et al.: J. Pept. Res, 52(5), 384-389 (1998)
[7] Szabó I. et al.: Bioconjug Chem. 20(4):656-665 (2009)
[8] Orbán E. et al.: Amino Acids. 41(2):469-483 (2011)
[9] Schlage P. et al.: J Control Release. 156(2):170-178 (2011)
[10] Mező G. et al.: Curr Med Chem. 15(23):2366-2379 (2008)

Weitere Literatur ist direkt bei der Autorin erhältlich.

 

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