Acrolein aus Lebensmitteln

Analytische Erfassung der Humanbelastung

  • Abb. 1: Derivatisierung des Acroleins mit Pentafluorphenylhydrazin (A) und die Massenspektren (MSCI) der Pentafluorphenylhydrazinderivate des Acroleins (B, [2]) und des [13C3]-Acroleins (C, [2]).Abb. 1: Derivatisierung des Acroleins mit Pentafluorphenylhydrazin (A) und die Massenspektren (MSCI) der Pentafluorphenylhydrazinderivate des Acroleins (B, [2]) und des [13C3]-Acroleins (C, [2]).
  • Abb. 1: Derivatisierung des Acroleins mit Pentafluorphenylhydrazin (A) und die Massenspektren (MSCI) der Pentafluorphenylhydrazinderivate des Acroleins (B, [2]) und des [13C3]-Acroleins (C, [2]).
  • Abb. 2: Stoffwechselwege des Acroleins zu im Urin ausscheidbaren Merkaptursäuren; CYP2E1 = Cytochrom P-450 2E1; GSH = Glutathion, γ-GT = γ-Glutamyltranspeptidase, CG = Cysteinylglycinase, NAT = N-Acetyltransferase, AKR = Aldo-Keto-Reduktase, DDH = Aldehyddehydrogenase; 3-HPMA = 3-Hydroxypropylmerkaptursäure (N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)-L-cystein), CEMA = Carboxyethylmerkaptursäure (N-Acetyl-S-(2-carboxyethyl)-L-cystein).
  • Abb. 3: Chromatogramme im Selected-Reaction-Monitoring(SRM)-Modus der Referenzmaterialien 3-Hydroxypropylmerkaptursäure (3-HPMA) (A, oben) mit m/z 220 → 91 und dem deuterierten internen Standard [D3]-3-HPMA (A, unten) mit m/z 223 → 91 sowie das Massenspektrum (ESI-MS) der 3-Hydroxypropylmerkaptursäure (3-HPMA) registriert im Negativ-Ionen-Scan-Modus (B).

α,β-ungesättigte aliphatische Carbonylverbindungen kommen natürlicherweise in vielen Lebensmitteln vor, entstehen aber auch als unerwünschte Kontaminanten bei deren thermischer Behandlung. Typische Beispiele hierfür sind das als genotoxisches Kanzerogen bekannte Acrylamid und das als einfachster Vertreter dieser Stoffgruppe geltende Acrolein.

Im vorliegenden Beitrag werden die zurzeit verfügbaren analytischen Methoden zur Bestimmung von Acrolein in Lebensmitteln zusammengefasst und der Forschungsbedarf als Grundlage für mögliche gesetzliche Regelungen dargestellt.

Einleitung
Bei der thermischen Behandlung von Lebensmitteln können verschiedene unerwünschte Lebensmittelkontaminanten entstehen, so z. B. auch α,β-ungesättigte aliphatische Carbonylverbindungen. Das leichtflüchtige Acrolein (Struktur, Abb. 1 A) gehört zu dieser Stoffgruppe und beansprucht derzeit hohes toxikologisches Interesse, da es akut zelltoxisch wirkt, insbesondere durch seine ausgeprägte Fähigkeit an SHGruppen von Proteinen zu binden. Darüber hinaus werden Addukte des Acroleins mit der DNA sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen. Obgleich diese Befunde auf eine genotoxische Wirkung in vivo schließen lassen, ist eine mögliche kanzerogene Wirkung schwierig nachzuweisen und daher derzeit auch nicht belegt.

Die Bildung von Acrolein in Lebensmitteln ist seit den 1960-iger Jahren bekannt und erfolgt während hitzebasierter Verarbeitungsprozesse durch Abbaureaktionen von Pflanzenfetten und verschiedenen Aminosäuren. Besonders in heißem Pflanzenöl gegarte Kartoffelzubereitungen sind mit Acrolein belastet, wie sich aus Biomonitoring- Daten und Gehaltsmessungen in den erhitzten Pflanzenölen ableiten lässt. Erhitzte Pflanzenöle können je nach Sorte und verwendeter Temperatur Acrolein-Konzentrationen bis in den mittleren ppm-Bereich enthalten. Darüber hinaus wird es während der Maillard-Reaktion zusammen mit Acrylamid freigesetzt.

Es ist zu erwarten, dass thermische Verfahren der Lebensmittelbehandlung, die zur Bildung von Acrylamid führen, ebenso die Bildung von Acrolein induzieren können, auch wenn es sich um unterschiedliche Vorläufermoleküle und Bildungsmechanismen handelt.

Acrolein kommt in geringer Menge in zahlreichen unbehandelten Früchten, in verschiedenen Gemüsen sowie in Fisch und Käse vor. Auch in Spirituosen und Wein wird es nachgewiesen. Es ist ebenfalls als Bestandteil flüchtiger Aromen von Lebensmitteln bekannt. Seine Aufnahme durch den Menschen erfolgt aber nicht ausschließlich aus Lebensmitteln. Auch die inhalative Aufnahme, z. B. durch Tabakkonsum, und endogene Stoffwechselprozesse tragen zur humanen Exposition bei. Im Gegensatz zum Acrylamid reichen die vorhandenen Daten zum Vorkommen von Acrolein in Lebensmitteln nicht aus, um die Humanexposition gegenüber diesem Stoff derzeit zuverlässig abzuschätzen. Die Expositionshöhe stellt aber ein wesentliches Kriterium zur Bewertung eines potenziellen gesundheitlichen Risikos durch Aufnahme solcher prozessbedingter Verbindungen dar.

Analytik in Lebensmitteln
Die zuverlässige Bestimmung des Acroleins in Lebensmittelproben stellt aufgrund seiner Flüchtigkeit, seiner chemischen Reaktivität und eines fehlenden Chromophors eine besondere Herausforderung dar. Zudem ist Acrolein sehr gut wasserlöslich und neigt in wässriger Lösung zur Polymerisation. Bereits die Probenahme und die Lagerung von Lebensmittelproben bedürfen besonderer Vorkehrungen, um einen Verlust an Acrolein weitestgehend zu vermeiden.

Die hohe Flüchtigkeit des Acroleins erlaubt ohne weitere Probenvorbereitung eine direkte Bestimmung mittels Headspace-Techniken gekoppelt mit einer GC-MS-Analyse. Als Nachteil dieser Methodik erweist sich allerdings die eingeschränkte Selektivität aufgrund der möglichen Koelution mit anderen flüchtigen Komponenten einer zu untersuchenden Matrix. Grundsätzlich ermöglicht eine Derivatisierung des Acroleins, wie auch im Fall von anderen leichtflüchtigen α,β-ungesätttigten Carbonylverbindungen, eine Überführung in stabile Analyte, wie z. B. Oxime und Hydrazone. Damit werden eine bessere Wiederfindung des Acroleins und auch eine höhere Empfindlichkeit der Analysenmethode erreicht. Dabei haben sich als Derivatisierungsreagentien für eine HPLCoder UV-gestützte Bestimmung des Acroleins das 2,4-Dinitrobenzylhydroxylamin und für eine GC-FID-gestützte Analyse das Pentafluorbenzylhydroxylamin sowie das Pentafluorphenylhydrazin durchgesetzt. Auch eine Headspace- Festphasenmikroextraktion (HS-MSPE) mit einer direkten Derivatisierung auf der Faser zum Pentafluorphenylhydrazon gekoppelt mit einer GCECD- Bestimmung ist möglich.

Eine verbesserte Analyse bietet die erst kürzlich für das Acrolein entwickelte Methodik nach dem Stabilisotopenverdünnungsprinzip. Als interner Standard steht ein isotopenmarkiertes [13C3]-Acrolein kommerziell zur Verfügung [1], welches direkt der zu untersuchenden Lebensmittelprobe zugesetzt wird. Das Verfahren nutzt eine anschliessende Derivatisierung mit Pentafluorphenylhydrazin (Abb. 1, A) gefolgt von einer GC-MS/MS Bestimmung des markierten und unmarkierten Pentafluorphenylhydrazons. Die mit chemischer Ionisation erhältlichen Massenspektren (Abb. 1, B+C) sind durch unterschiedliche Molekül-Ionen charakterisiert, wohingegen alle Fragment-Ionen aus dem Strukturteil des Pentafluorhydrazins entstehen und daher für beide Derivate indentisch sind. Die mit diesem Verfahren erzielten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für die Quantifizierung von Acrolein in Pflanzenöl liegen bei 20 bzw. 60 μg/kg [1].

Da derzeit keine standardisierte und durch Laborvergleichsuntersuchungen validierte Acrolein- Bestimmung zur Verfügung steht und die verfügbare Datenlage für Acrolein in Anbetracht der Vielzahl an Lebensmittematrizes noch stark eingeschränkt ist, kann eine humane Belastung aus der Nahrungsaufnahme schlecht abgeleitet werden. Eine Abschätzung der humanen Belastung aus Ergebnissen der Analyse von Biomarkern kann hier eine mögliche alternative Strategie sein.

Biomonitoring
Eine alternative Möglichkeit, die Humanexposition gegenüber Acrolein aus Lebensmitteln abzuleiten, bietet die quantitative Analyse von ausgeschiedenen Merkaptursäuren als Biomarker des Acroleins im Urin. Nach direkter Michael-Addition von Glutathion an Acrolein unter zusätzlicher Katalyse durch Glutathiontransferasen wird nach metabolischer Umwandlung des Glutathionylrestes und Reduktion der Aldehydgruppe die 3-Hydroxy-propylmerkaptursäure (3-HPMA) ausgeschieden, wohingegen eine konkurrierende Oxidation der Aldehydgruppe zur Ausscheidung der 2-Carboxyethylmerkaptursäure (CEMA) führt (Abb. 2). Eine dritte Merkaptursäure kann nach einer initialen Epoxidierung des Acroleins mittels CYP2E1 aus dem intermediären Glycidaldehyd entstehen (Abb. 2). Im Humanurin werden insbesondere 3-HPMA und CEMA ausgeschieden.

Als Methode der Wahl für die Bestimmung von polaren Metaboliten aus dem Urin wie 3-HPMA wird nach Probenvorbereitung die Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit nachgeschalteter Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) nach dem Stabilisotopenverdünnungsprinzip eingesetzt [2 – 4]. Mittels LC-ESI-MS/ MS lassen sich simultan zur 3-HPMA auch Merkaptursäuren anderer niedermolekularer Kontaminanten in Lebensmitteln, wie z. B. Acrylamid und Glycidol, sensitiv bestimmen [2,3], sodass sich die Methodik potenziell zu einer Profilanalyse von Merkaptursäuren solcher elektrophilreaktiver Lebensmittelkontaminanten ausbauen lässt. Zur Probenvorbereitung wird nach Auftauen der Urinprobe ein Aliquot mit einem internen Standard, wie z. B. [D3]-3-HPMA, versetzt und mit Ammoniumformiatpuffer auf pH 2,5 eingestellt. Nach Aufreinigung mittels Festphasenextraktion kann die Quantifizierung mittels LC-ESI-MS/MS im Selected-Reaction-Monitoring(SRM)-Modus anhand des charakteristischen Vorläufer/Produkt- Ionenpaars m/z 220 → 91 erfolgen (Abb. 3). Mit dieser Methode wird eine Detektionsgrenze von 3 μg/l erreicht. Bei der Interpretation der gefundenen Werte muss allerdings berücksichtigt werden, dass bei Rauchern ein erheblicher Anteil der 3-HPMA aus der Aufnahme von Acrolein durch Tabakkonsum stammt. Als weitere Quellen umfasst die Bestimmung der 3-HPMA auch eine mögliche inhalative Aufnahme und eine endogene Bildung des Acroleins aus der Lipidperoxidation. Unter Annahmen für die ausgeschiedene Tagesmenge an Urin und für die orale Bioverfügbarkeit sowie des prozentualen Anteils, in welchem Acrolein als 3-HPMA im Urin ausgeschieden wird, lassen sich die ungefähren Aufnahmemengen aus Lebensmitteln für Nichtraucher abschätzen [5].

Weiterer Forschungsbedarf
Die Senatskommission zur gesundheitlichen Bewertung von Lebensmitteln (SKLM) der Deutschen Forschungsgemeinschaft hat in einer vor kurzem erschienenen Stellungnahme die Datenlage zu Acrolein und Acrylamid vergleichend diskutiert und u. a. den Forschungsbedarf im Fall des Acroleins definiert [6]. In diesem Zusammenhang wies die SKLM darauf hin, dass zuverlässige Daten zum Vorkommen des Acroleins in unverarbeiteten bzw. verzehrfertigen Lebensmitteln sowie über den Einfluss von Verarbeitungs- und Zubereitungsprozessen (wie Braten oder Frittieren) fehlen.

Die SKLM empfiehlt, nicht nur eine zuverlässige Analytik zur Erfassung von Acrolein in Lebensmitteln zu entwickeln, sondern auch die Exposition über Lebensmittel vergleichend zu Acrylamid mittels validierter Biomarker wie der entsprechenden Merkaptursäuren im Urin oder der Hämoglobin-Addukten im Blut zu erfassen. Darüber hinaus ist zu klären, ob ein Biomarker zur Bestimmung der Langzeitexposition gegenüber Acrolein entwickelt werden kann, in welchem Ausmaß die Belastungen aus endogenen und exogenen Quellen zur Gesamtexposition beitragen, und worauf die beobachtete Diskrepanz zwischen den bisher erfassten analytischen Messwerten zur Ausscheidung von Expositionsbiomarkern im Urin basiert.

Um eine Risikobewertung von Acrolein vornehmen zu können, sind außerdem Studien zur Genotoxizität und Mutagenität (beide in vitro und in vivo) erforderlich. Mit Hilfe von Studien zur Biokinetik von Acrolein nach oraler Exposition sollte geklärt werden, ob das oral aufgenommene Acrolein systemisch in solch einer Menge verfügbar wird, dass DNA-Addukte in verschiedenen Organen gebildet werden. Schließlich ist die Frage zu beantworten, ob die gemeinsame Exposition gegenüber Acrolein und Acrylamid die biologische Wirkung der jeweiligen Einzelsubstanzen beeinflusst.

Fazit
Die zunehmenden Anforderungen an die Qualitätssicherung bei der Herstellung und Verarbeitung von Lebensmitteln sowie an den Bereich der Lebensmittelüberwachung machen eine rasche Entwicklung und/oder Verbesserung analytischer Methoden für eine Vielzahl von Kontaminanten erforderlich. Für Acrolein stehen zu seiner zuverlässigen Bestimmung in den betroffenen Lebensmittelmatrices verschiedene Methoden zur Verfügung, für deren breite Anwendung jedoch noch eine Standardisierung und Validierung durch Laborvergleichsuntersuchungen erforderlich ist. Zur Bewertung der Humanbelastung mit Acrolein erscheinen aktuell Bestimmungen von Biomarkern im Urin im Rahmen von Biomonitoring-Studien ein aussichtsreicher Ansatz zu sein.

Literatur
[1] Ewert A. et al.: J. Agric. Food Chem. 59, 3582-3589 (2011)
[2] Ding Y. S. et al.: Chem. Res. Toxicol. 22, 1018-1025 (2009)
[3] Eckert E. et al.: Int. J. Hyg. Environ. Health 214, 196-204 (2011)
[4] Schettgen T. et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2629-2638 (2008)
[5] Abraham K. et al.: Mol. Nutr. Food Res. 55, 1277- 1290 (2011)
[6] SKLM (http://www.dfg.de/download/pdf/dfg_im_ profil/reden_stellungnahmen/2012/sklm_thermisch_ induzierten_prozesskonta) vom 19.11.2012.

Kontakt
Priv.-Doz. Dr. Albrecht Seidel
Biochemisches Institut für Umweltcarcinogene
Prof. Dr. Gernot Grimmer-Stiftung
Großhansdorf
Tel.: 04102/62155
albrecht.seidel@biu-grimmer.de

Prof. Dr. Pablo Steinberg
Institut für Lebensmitteltoxikologie
und Chemische Analytik
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tel.: 0511/856-7545
pablo.steinberg@tiho-hannover.de

Autor(en)

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Prof. Dr. Grimmer- Stiftung
Lurup 4
22927 Großhansdorf
Telefon: 04102/62155
Telefax: 04102/63028

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