Extended shelf life (ESL)-Milch

Milch mit übermäßiger Hitzebelastung?

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  • Abb. 1: SDS-PAGE der Gesamtmilchprotein-Fraktion (a), und Alkalische PAGE der bei pH 4,6 säurelöslichen Molkenprotein-Fraktion (b) verschiedener ESL-Milchproben aus Österreich.
  • Abb. 2: RP-HPLC-Chromatogramm der säurelöslichen Molkenproteine in pasteurisierter Milch (a), UHT-Milch (b) und in ESL-Milchproben „guter“ (c) und „schlechter“ (d) Qualität.
  • Abb. 3: RP-HPLC-Chromatogramm von Furosin in ESL-Milchproben „guter” (a) und „schlechter“ (b) Qualität.
  • Prof. Dr. Helmut K. Mayer, Leiter der Abteilung Lebensmittelchemie am Department für Lebensmittelwissenschaften und -technologie an der Universität für Bodenkultur Wien

In jüngster Zeit kann ein scheinbar unaufhaltbarer Trend in Richtung „länger frische" Milch festgestellt werden. Da es derzeit aber noch keine verbindlichen Regelungen für die maximal zulässige Hitzebelastung von ESL-Milch in Europa gibt, bedarf es der Einführung gesetzlicher Grenzwerte für Erhitzungsindikatoren (z.B. säurelösliches ß-Lactoglobulin, Furosin) zur Abschätzung und Kontrolle der tatsächlichen Hitzebelastung von Milch mit verlängerter Haltbarkeit, um eine hohe ernährungsphysiologische und sensorische Qualität von ESL- Milch auch in Zukunft zu gewährleisten.

Die relative kurze Haltbarkeitsdauer von pasteurisierter Milch führte zur Entwicklung von ultra-hocherhitzter Milch, wobei diese sog. UHT-Milch nach Ultra-Hoch-Temperatur-Behandlung mindestens 3 Monate oder länger ungeöffnet bei normaler Umgebungstemperatur haltbar ist, und aus diesem Grunde in vielen Ländern bereits hohe Akzeptanz erlangt hat (z.B. Frankreich, Deutschland, Portugal, Spanien). In anderen Ländern wiederum stehen die Konsumenten dieser Haltbarmilch wegen des zum Teil sehr stark ausgeprägten Kochgeschmacks eher skeptisch gegenüber (z.B. Österreich, Griechenland, Irland, Niederlande, Großbritannien). In den letzten Jahren kann ein scheinbar unaufhaltbarer Trend in Richtung einer „neuen" Konsummilchart festgestellt werden, die verlängerte Haltbarkeit bei gleichzeitig geringen negativen Begleiterscheinungen (wie z.B. Kochgeschmack, Vitaminverluste) bewirbt. Diese auf der Packung als „länger frisch" bezeichnete sogenannte ESL-Milch (Extended Shelf Life) weist eine Haltbarkeit von mindestens 21 Tagen bei Kühlschrank-Temperaturen auf, wobei sensorisch im Vergleich zur herkömmlichen Frischmilch nahezu keine qualitativen Einbußen feststellbar sein sollen. Eine genaue Definition hinsichtlich der Bezeichnung und Haltbarkeit für den Begriff ESL-Milch gibt es aber bisher nicht [3, 4, 7].

Die gegenwärtig eingesetzten technologischen Verfahren zur Herstellung von ESL-Milch sind die Mikrofiltration bzw. Tiefenfiltration, direkte Erhitzung mittels Injektions- bzw. Infusionsverfahren (z.B. 127°C für 2-3 s), oder kostengünstigere indirekte Erhitzungsverfahren (z.B. 125°C für 2 s). Die Hocherhitzung der Milch führt - in Abhängigkeit von der tatsächlichen Hitzebelastung der Milch - zu einem mehr oder weniger signifikanten Verlust an organoleptischer und ernährungsphysiologischer Qualität (z.B.

Kochgeschmack, Vitaminverluste, Präzipitation von Calciumphosphat, Denaturierung der hitzelabilen Molkenproteine, Maillard-Reaktion, Verlust an essentiellen Aminosäuren wie Lysin). Zudem kommt es zu technologisch unerwünschten Ablagerungen denaturierter Proteine und Mineralstoffe an den Oberflächen der Wärmeaustauscher [4, 6, 7].

Um den tatsächlichen Einfluss des erfolgten Erhitzungsprozesses quantifizieren zu können, wurden eine Reihe von Erhitzungsindikatoren in der Literatur beschrieben, wobei sich einige milchspezifische Komponenten besonders als potentielle Erhitzungsindikatoren zur Abschätzung der wahren Hitzebelastung von erhitzter Milch anbieten (z.B. die Enzyme Alkalische Phosphatase und Lactoperoxidase, das Molkenprotein ß-Lactoglobulin, Hydroxymethylfurfural (HMF), Lactulose, Furosin). Typ I-Reaktionen umfassen die Denaturierung, Degradation und Inaktivierung von hitzelabilen Komponenten (hauptsächlich die Molkenproteine, milcheigene Enzyme und Vitamine) - diese Indikatoren sind bestens für die Bewertung einer eher geringeren Temperaturbehandlung bzw. Hitzebelastung geeignet, während Typ II-Reaktionen die Neubildung von Substanzen beinhalten, welche in nicht-erhitzter Milch (fast) nicht vorkommen (z.B. Lactulose, HMF, Furosin) - diese Indikatoren sind besser für die Abschätzung einer stärkeren Hitzebelastung geeignet [1, 2].

Die quantitative Bestimmung von säurelöslichem ß-Lactoglobulin (ß-Lg) wurde zur Unterscheidung verschiedener Kategorien hitzebehandelter Milch vorgeschlagen. So gelten laut Internationalem Milchwirtschaftsverband folgende Mindestwerte: 2.600 mg/l für pasteurisierte Milch, 2.000 mg/l für hoch-pasteurisierte Milch und 50 mg/l für UHT-Milch. Weiters wurde die Bildung von Furosin als Indikator für hitze-induzierte Veränderungen in Milchprodukten beschrieben, wobei folgende obere Grenzen vorgeschlagen werden: 8 mg/100 g Protein für Pasteurisation, 20 mg/100 g Protein für Hoch-Pasteurisation, und 250 mg/100 g Protein für UHT-Erhitzung [2, 6].

Obwohl derzeit (noch) keine gesetzlich verbindlichen Regelungen bzw. Grenzwerte für die maximal zulässige Hitzebelastung von ESL-Milch in Europa vorliegen, werden doch allgemeine Empfehlungen in der Fachliteratur abgegeben (ß-Lg > 1.800 mg/l; Furosine < 12 mg/100 g Protein, und Lactulose < 30 mg/l), welche zwar von einzelnen Molkereien berücksichtigt werden, von den meisten ESL-Milch-Produzenten aber vollkommen ignoriert werden, weil es bis dato keinerlei Kontrollen bzw. Konsequenzen durch die Lebensmittelkontrollbehörden gibt [1, 3].

Da die ESL-Milch mit der Bezeichnung „länger frisch" im Kühlregal angeboten wird und diese „neue Kategorie" von Trinkmilch bei Temperaturen < 6°C gelagert werden muss, gilt sie beim Konsumenten generell als wertvolles „Frisch"-Produkt mit dem Vorteil einer längeren Haltbarkeit (als gelungener Kompromiss zwischen „natürlichem" Lebensmittel und Convenience-Produkt). Aus diesem Grunde findet derzeit in den Supermarktregalen eine rasante Verdrängung der „normalen" pasteurisierten Trinkmilch durch die länger haltbare ESL-Milch statt, wobei viele Konsumenten diese schleichende Markteinführung bedingt durch eine unzureichende Kennzeichnung und mangels Information de facto nicht/kaum bemerken. Da es aufgrund fehlender gesetzlicher Regelungen (z.B. Grenzwerte für ß-Lactoglobulin, Furosin oder Lactulose) keinerlei Kontrolle der tatsächlichen Hitzebelastung von ESL-Milchprodukten am Markt gibt, könnten sich durch die z.T. verringerte ernährungsphysiologische und sensorische Qualität von ESL-Milch unvorhergesehene Konsequenzen für die Ernährung des Menschen ergeben, dem unbemerkt und schleichend eine haltbare „Konserve" weiterhin als „Frisch"-Produkt vorgegaukelt wird.

Ziel dieser Studie war es daher, die elektrophoretische Analyse von säurelöslichem ß-Lactoglobulin als schnelles Screening-Verfahren einzusetzen und kostengünstige chromatographische Methoden für die Bestimmung von Furosin und säurelöslichem ß-Lactoglobulin zu etablieren, um die tatsächliche Hitzbelastung von ESL-Milchproben am österreichischen Markt zu untersuchen.

Material und Methoden

Milchproben
Konsummilch-Handelsproben (n = 128) unterschiedlicher Erhitzungsklassen von verschiedenen Molkereien wurden in österreichischen Märkten eingekauft. Proben von Rohmilch (n = 7), pasteurisierter Milch (n = 33), ESL-Milch mit der Bezeichnung „länger frisch" (n = 71), und UHT-Milch (n = 17) wurden aliquotiert und für die nachfolgenden elektrophoretischen und chromatographischen Analysen tiefgefroren.

RP-HPLC von säurelöslichem ß-Lactoglobulin
Die quantitative Bestimmung des säurelöslichen ß-Lactoglobulins in flüssigen Milchproben wurde mittels Reversed-phase Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) entsprechend dem FIL/IDF-Standard 178 (2005) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Caseine und denaturierte Molkenproteine wurden nach Zugabe von 2M HCL bei pH 4,6 präzipitiert. Die saure Molke mit den säurelöslichen Molkenproteinen wurde durch Zentrifugation abgetrennt und mit Natriumphosphat-Puffer verdünnt.

Die RP-HPLC wurde mittels Chromatographie-System von Waters durchgeführt: Model 600E. Die Detektion erfolgte bei 205 nm mittels UV/VIS Detektor (Waters 2489), die Steuerung und Auswertung erfolgte mittels Millennium Chromatography manager [5].

RP-HPLC von Furosin

Die Probenvorbereitung inklusive saurer Hydrolyse und Aufreinigung der Hydrolysate mittels Festphasenextraktion vor der chromatographischen Trennung wurde nach FIL/IDF-Standard 193 (2004) mit einigen Modifikationen durchgeführt. Zur chromatographischen Trennung des Furosins [ε-N-(2-Furoylmethyl)-L-lysin] wurde allerdings nicht die im FIL/IDF-Standard vorgeschlagene Säule (specific "Furosine dedicated" RP-HPLC C8 column) verwendet, sondern dieselbe Säule (Waters Symmetry 300 C18 column) wie für die Analyse des ß-Lactoglobulins. Der für die Berechung des Furosingehaltes (mg/100 g Protein) erforderliche Proteingehalt der Milchproben wurde mittels Kjeldahl-Methode bestimmt [5].

SDS-PAGE von Milchproteinen
Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) wurde zur Analyse der Gesamtproteinfraktion sowie auch der säurelöslichen Mokenprotein-Fraktion eingesetzt. Milchproben bzw. saure Molken (nach isoelektrischer Präzipitation des Caseine und denaturierten Molkenproteine!) wurden direkt in Probenpuffer verdünnt, mit Dithiothreitol (DTT) vermischt und im Thermoblock erhitzt (10 min bei 100°C). Nach dem Rückkühlen auf Raumtemperatur wurde erneut DTT-Lösung als Reduktionsmittel zugegeben, und anschließend die Proteine mittels SDS-PAGE (15% T) aufgetrennt [5].

Alkalische PAGE von Molkenproteinen
Die alkalische PAGE wurde zur elektrophoretischen Trennung der säurelöslichen Molkenproteine eingesetzt. Saure Molken wurden direkt mit Probenpuffer verdünnt, mit Bromphenolblau-Lösung vermischt und in einer vertikalen Elektrophorese-Apparatur SE 600 mittels Nativer PAGE (12.5% T) aufgetrennt [5].

Ergebnisse und Diskussion

Elektrophorese von Milchproteinen

In dieser Studie wurde die Elektrophorese der Milchproteine als schnelles und zuverlässiges Screening-Verfahren zur Abschätzung der Hitzebelastung von Trinkmilch sowie zur Unterscheidung unterschiedlicher Erhitzungsklassen von Konsummilch eingesetzt. Die elektrophoretische Trennung der Gesamtmilchprotein-Fraktion mittels SDS-PAGE wurde lediglich zur Bestätigung eines einheitlichen Bandenmusters aller untersuchten ESL-Milchproben durchgeführt. Nach Kochen der Proben mit SDS und DTT zeigen alle Milchproben - unabhängig von der Hitzebelastung während der Produktion in der Molkerei - das gleiche Bandenmuster (intensive Caseine, starkes ß-Lg und etwas schwächeres α-La) (Abb. 1a). Demgegenüber zeigen aber die untersuchten ESL-Milchproben nach Auftrennung ihrer säurelöslichen Molkenproteine mittels alkalischer PAGE vollkommen unterschiedliche Bandenmuster. Da das im Zuge der Probenvorbereitung präzipitierte Casein (inklusive den hitzedenaturierten Molkenproteinen!) durch Zentrifugation abgetrennt worden war, können in den sauren Molken lediglich die bei pH 4,6 säurelöslichen (d.h. nicht hitze-denaturierten) Molkenproteine nachgewiesen werden (Abb. 1b). Es ist offenkundig, dass die Bandenintensität der säurelöslichen Molkenproteine mit zunehmender Hitzebelastung der untersuchten Trinkmilchproben abnimmt, wobei die Hitzestabilität der Molkenproteine wie folgt abnimmt: α-La > ß-Lg > BSA > Immunoglobuline. Daher nehmen einzelne Molkenproteinfraktionen in Abhängigkeit von ihrer individuellen Hitzestabilität als Folge von Erhitzungsprozessen im Zuge der Produktion von Trinkmilch ab, und können somit als Indikatoren für die tatsächliche Hitzebelastung von Handelsmilchproben verwendet werden. Unter Berücksichtigung der zuletzt extrem gestiegenen Kosten des für die HPLC-Analyse von ß-Lactoglobulin und Furosin erforderlichen Acetonitrils, erweist sich die Elektrophorese als rasches, kostengünstiges und verlässliches Screening-Verfahren zur Unterscheidung zwischen niedrig-erhitzten und hoch-erhitzten ESL-Milchproben.

RP-HPLC von säurelöslichem ß-Lactoglobulin in Milchproben
Der offensichtliche Unterschied zwischen ESL-Milchproben „guter" bzw. „schlechter" Qualität (d.h. ESL-Milchproben mit geringer bzw. hoher Hitzebelastung!) wird in Abb. 2 gezeigt. Pasteurisierte Milch weist selbstverständlich nur eine geringe Hitzebelastung auf und hat einen hohen Gehalt (> 3.000 mg/l) an säurelöslichem ß-Lactoglobulin (Abb. 2a). Interessanterweise zeigten die im Rahmen dieser Studie untersuchten ESL-Milchproben von verschiedenen Herstellern erstaunlich große Unterschiede hinsichtlich ihrer tatsächlichen Hitzebelastung und somit dem Gehalt an säurelöslichem ß-Lg (3.680 bis 140 mg/l). Abb. 2c zeigt das Chromatogramm der säurelöslichen Molkenproteine einer niedrig erhitzten ESL-Milchprobe mit hohem ß-Lg-Gehalt (2792 mg/l), während eine offenkundig übermäßig hoch erhitzte ESL-Milchprobe mit extrem niedrigem ß-Lg-Gehalt (260 mg/l) in Abb. 2d dargestellt ist. Mehr als die Hälfte der untersuchten ESL-Milchproben hatte einen Gehalt an säurelöslichem ß-Lg <1800 mg/l, was als Grenzwert für ESL-Milch in Österreich diskutiert wird. Einige ESL-Milchproben wiesen einen extrem niedrigen Anteil (212 mg/l) an nativem (d.h. nicht hitzedenaturierten) ß-Lg auf, was durchaus einer stark hitzebelasteten UHT-Milch entspricht (Abb. 2b).

RP-HPLC von Furosin in Milchproben
Da im Rahmen dieser Studie Furosin sowie auch ß-Lg von vielen Milchproben in alternierender Abfolge bestimmt werden sollten, wurde eine RP-HPLC-Methode für die Analyse von Furosin entwickelt, welche dieselbe HPLC-Säule wie für die Bestimmung von ß-Lg verwendet, wodurch das ständige Wechseln der Säule vermieden werden konnte. Im Vergleich zur IDF-Standardmethode (22 min) konnte Furosin unter Verwendung dieser Säule bereits innerhalb von 8 Minuten getrennt werden. In guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen der ß-Lg-Bestimmung konnten die extremen Unterschiede zwischen ESL-Milchproben „guter" bzw. „schlechter" Qualität (d.h. ESL-Milchproben mit geringer bzw. hoher Hitzebelastung) auch durch Bestimmung des Furosin-Gehaltes demonstriert werden. Abb. 3a zeigt das typische Chromatogramm von Furosin (11,6 mg/100g Protein) in ESL-Milch „guter" Qualität (natives ß-Lg: 2.729 mg/l Milch), während in Abb. 3b ein Furosin-Chromatogramm (71,3 mg/100 g Protein) einer ESL-Milch sehr „schlechter" Qualität (natives ß-Lg: 246 mg/l Milch) dargestellt ist.

Ausblick


Bei der Etablierung verbindlicher Regelungen bzw. Grenzwerte für die maximal zulässige Hitzebelastung von ESL-Milch in Europa wird es erforderlich sein, die verschiedenen Erhitzungsindikatoren auf ihre Zuverlässigkeit hinsichtlich der Beurteilung von Milchproben zu überprüfen bzw. zu vergleichen. Aus diesem Grunde werden im 2. Teil dieses Artikels die Ergebnisse der beiden - wahrscheinlich am besten geeigneten - Erhitzungsindikatoren (säurelösliches ß-Lactoglobulin, Furosin) miteinander verglichen, um eine mögliche Übereinstimmung bzw. Abweichung bei der Interpretation darzustellen.

Literatur

[1] Cattaneo S. et al.: Effects of overprocessing on heat damage of UHT-milk, Eur. Food Res. Technol. 226 1099-1106 (2008)
[2] Claeys W.L. et al.: Intrinsic time temperature integrators for heat treatment of milk, Trends Food Sci. Technol. 13 293-311 (2002)
[3] Dyck B.: Neue Marktchancen durch ESL-Technologie, Dt. Molk. Ztg. (dmz) 20 22-25 (2004)
[4] Gallmann P. et al.: Vor- und Nachteile der ESL (Extended Shelf Life)-Milch, Agrarforschung 8, 112-117 (2001)
[5] Mayer H.K. et al.: RP-HPLC analysis of furosine and acid-soluble β-lactoglobulin to assess the heat load of extended shelf life milk samples in Austria. Dairy Science and Technology (in press).
[6] Rysstad G. und Kolstad J.: Extended shelf life milk - advances in technology, Int. J. Dairy Technol. 59, 85-96 (2006)
[7] Schwermann S. und Schwenzow U.: Verfahrenskonzepte zur Herstellung von ESL-Milch, Dt. Milchwirt. 59, 384-391, 428-432, 462-467 (2008)

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Universität für Bodenkultur (BOKU) Wien
Gregor-Mendel-Str. 33
1180 Wien
Österreich

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