Fluoreszenzspektroskopie

Prozessanalysatoren in der Lebensmittelproduktion

  • Abb. 1: Differenzspektren einer Hefekultivierung und einer WeizensauerteigfermentationAbb. 1: Differenzspektren einer Hefekultivierung und einer Weizensauerteigfermentation
  • Abb. 1: Differenzspektren einer Hefekultivierung und einer Weizensauerteigfermentation
  • Abb. 2: Die aus den Fluoreszenzspektren vorhergesagten Prozessgrößen Glucose-, Biotrockenmasse- und Ethanolkonzentration der Hefekultivierung gegen ihre Offlinemesswerte
  • Abb. 3: Die aus den Fluoreszenzspektren vorhergesagte Prozessgröße Säuregrad gegen ihre Offlinemesswerte

Die ersten verfahrenstechnischen Prozesse dienten zur Herstellung von Lebensmitteln. Zur Prozessüberwachung nutzten die Betreiber ihre Sinnesorgane, d. h. die Prozessanalytik basierte auf Riechen, Schmecken, Tasten, Sehen und Hören. Auch heutzutage kann manch erfahrener Prozessführer den Zustand von Prozesskomponenten über seine Sinnesorgane erfassen. Die verfahrenstechnischen Prozesse sind jedoch inzwischen breiter aufgestellt und ihre Komplexität hat deutlich zugenommen.

Die Anforderungen an die Prozessanalytik sind deutlich gestiegen. Dies gilt insbesondere für biotechnische Prozesse, die Mikroorganismen nutzen, um ein Produkt herzustellen. So wird die Hefe Saccharomyces cerevisiae unter anderem zur Bier- und Brotherstellung, aber auch zur Produktion heterologer Proteine verwendet. Zur Überwachung dieser Prozesse eignen sich Fluoreszenzanalysatoren, die bereits erfolgreich zum Monitoring von unterschiedlichen biotechnischen Prozessen eingesetzt wurden. Basierend auf dieser Technik können sowohl Substrate, die Biomasse als auch Produkte simultan bestimmt werden.

Fluoreszenzspektroskopie als Grundlage für Prozessanalysatoren
Die Fluoreszenzspektroskopie ist verglichen mit der UV/Vis-Spektroskopie deutlich empfindlicher. Ein 2D-Fluoreszenzspektrometer strahlt Licht einer Wellenlänge in eine Probe ein. Bei Absorption des Lichts durch eine fluoreszierende Substanz (Fluorophor) geht diese in einen elektronisch angeregten Zustand über. Aufgrund interner Konversionsprozesse sendet das angeregte Molekül Licht einer geringeren Energie wieder aus, um in den Grundzustand zurückzukehren. Das Emissionsspektrum des ausgesendeten Lichts ist charakteristisch für den Fluorophor. Wird das Anregungslicht variiert und jeweils das Emissionsspektrum registriert, erhält man das charakteristische 2D-Spektrum einer Probe. Jedoch liegt die eigentliche Messinformation verstreut im gesamten Spektrum vor. Die Intensitätswerte unterschiedlicher Wellenlängenkombinationen (Exzitation, Emission) sind zumeist linear abhängig voneinander, so dass multilineare Regressionsmodelle nicht verwendet werden können.

Die Messinformation muss mit entsprechenden Auswertungsverfahren extrahiert werden. Hierfür hat sich die Hauptkomponentenanalyse bewährt. Sie führt eine Transformation der Spektren durch, so dass neue linear unabhängige Daten erhalten werden, mit denen eine multilineare Regression möglich ist. Vor der eigentlichen Hauptkomponentenanalyse sind zumeist noch Verfahren der Datenvorverarbeitung von Bedeutung. Hier kann eine Glättung, Normierung oder Skalierung die Güte der Messdatenauswertung wesentlich verbessern. Die Fluoreszenzspektroskopie eignet sich insbesondere zum Monitoring von biotechnischen Prozessen, da es eine Reihe biogener Fluorophore gibt. Dies sind die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, die Kofaktoren NADH, FMD und FAD sowie die Vitamine Pyridoxin und Riboflavin. Auch die jeweilige Umgebung der Fluorophore beeinflusst das Spektrum. So hängt die Intensitätsverteilung in den Spektren auch vom pH-Wert und der Viskosität sowie von der Temperatur ab.

Als Fluoreszenzspektrometer wurde hier der BioView-Sensor (Delta Light & Optics, Dänemark) verwendet. Er nutzt als Lichtquelle eine Xenon-Blitzlampe und zur Wellenlängenselektion Filter. Alle 1,5 min wird ein Spektrum aufgenommen und an einen Computer übertragen. Liegen Kalibrierungsfunktionen für Prozessgrößen vor, können deren Werte online berechnet und zur Führung des Prozesses verwendet werden.

Monitoring einer Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae
Es wurden insgesamt vier Batch-Kultivierungen von Saccharomyces cerevisiae in einem Bioreaktor mit einem Volumen von 3,7 l durchgeführt. Für jeden Batch-Ansatz wurden 2,5 l Schatzmann-Mineral-Medium mit 15 g/l Glucose verwendet. Die Kultivierung der Hefen erfolgte unter sterilen Bedingungen bei 30°C, einem pH-Wert von 5, einer Rührerdrehzahl von 250 rpm und einer Begasungsrate von 195 l/h. Während des gesamten Prozesses wurden online 2DFluoreszenzspektren aufgenommen. Über den gesamten Verlauf der Kultivierung von 12 Stunden wurde stündlich eine Probe der Kulturbrühe entnommen, um die Biotrockenmasse- und die Glucose- sowie die Ethanolkonzentration zu bestimmen.

In Abbildung 1 a ist das 2D-Fluoreszenzspektrum als Differenzspektrum der Kultivierung dargestellt, d. h. von den Intensitätswerten des letzten Spektrums der Kultivierung sind jeweils die Werte des ersten Spektrums subtrahiert worden. Hierdurch sind die Änderungen zu beobachten, die während der Kultivierung auftreten und die zur Prozessbeobachtung genutzt werden können. Deutlich sind zwei intensive Peaks zu erkennen, im Proteinbereich (lex = 290 nm, lem = 350 nm) und in einem Bereich (lex = 330 nm, lem = 440 nm), in dem NADH fluoresziert. Der schwache Peak (lex = 450 nm, lem = 530 nm) liegt in einem Bereich, in dem Flavinmono- und -dinukleotid Fluoreszenz zeigen.

Zur Erstellung von Vorhersagemodellen mittels des Hauptkomponentenverfahrens Partial-Least-Squares (PLS) wurden zunächst für alle Spektren die Differenzspektren zum Anfangsspektrum der Kultivierung gebildet. Ferner erfolgte eine Glättung der Fluoreszenzspektren durch den Einsatz eines Medianfilters. Für die Bildung eines PLS-Regressionsmodells zur Vorhersage der Prozessgrößen wurden die online gemessenen Spektren und die offline gemessenen Konzentrationen von Glucose, Biotrockenmasse und Ethanol verwendet. Dabei wurden für die Phasen des Wachstums auf Glucose und Ethanol jeweils unterschiedliche Modelle berechnet.

Mit den Daten von drei Hefe-Kultivierungen wurden Kalibrationsmodelle für die Prozessgrößen erstellt. Eine Vorhersage dieser Prozessgrößen aus den Spektren einer neuen Kultivierung durch die erstellten Modelle erfolgte im Anschluss. Ein Vergleich der berechneten Prozessgrößen mit den realen Messwerten (siehe Abb. 2) zeigt die Qualität des Modells an. Der prozentuale Fehler dieser Vorhersage bezogen auf den maximalen Messwert lag bei 4,6 % für die Biotrockenmasse-, 3,3 % für die Glucose- und 5,4 % für die Ethanolkonzentration.

Monitoring einer Weizensauerteigfermentation
Für die Herstellung von Roggenbrot ist Sauerteig eine wesentliche Komponente. Sie dient der Säuerung, ist aber auch für das Aroma des Roggenbrots mit verantwortlich. Um auch aromatisches Weizenbrot herzustellen, kann auch hier Sauerteig verwendet werden. Die Produktion von Sauerteig erfolgt durch Fermentationen, bei denen neben Hefen vor allem Milchsäurebakterien zum Einsatz kommen. Während des Fermentationsprozesses bilden die Mikroorganismen hauptsächlich Milch- und Essigsäure. Dies führt zu einer Erniedrigung des pH-Werts sowie zu einer Erhöhung des Säuregrads, der ein Maß für die Pufferwirkung des Teigs ist. Für die Führung dieser Prozesse sind der pH-Wert und der Säuregrad von entscheidender Bedeutung. Onlinemesssysteme sind derzeit nicht verfügbar. Deshalb wurde untersucht, ob diese Größen basierend auf 2DFluoreszenzspektren bestimmt werden können.

Der Ansatz von drei Weizensauerteigführungen erfolgte mit jeweils einer Vorkultur, die aus 20 g einer speziellen Starterkultur (Weizen StartGut, Isern- Häger GmbH & Co. KG, Isernhagen), 200 g Weizenmehl und 240 g Wasser hergestellt wurde. Die Vorkultur wurde anschließend mit 1.136 g Weizenmehl, 1.364 g Wasser und 3 g Salz vermischt und für 24 Stunden unter konstantem Rühren (60 rpm) in einem Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 2,5 l fermentiert. Die Temperatur wurde während der Fermentation konstant gehalten. Über den gesamten Prozess wurden mit dem Sensor kontinuierlich 2D-Fluoreszenzspektren aufgenommen. In Abbildung 1 b ist das Differenzspektrum einer Weizensauerteigfermentation dargestellt. Im Vergleich zur Hefekultivierung ist die Fluoreszenzintensität deutlich geringer, was an dem hohen Feststoffanteil liegt. Nur ein intensiver Peak im Proteinbereich ist zu erkennen. Insgesamt ist auch bei diesem Prozess eine deutliche Änderung der Fluoreszenzintensität zu erkennen, die zur Berechnung des pH-Werts und des Säuregrads verwendet werden kann. Während der Fermentation wurden Teigproben entnommen und auf ihren pHWert und Säuregrad hin untersucht. Aus den originalen Spektren und den interpolierten Messwerten für die Prozessgrößen pH-Wert und Säuregrad zweier Fermentationen wurden PLSRegressionsmodelle berechnet. Diese wurden verwendet, um aus den 2D-Fluoreszenzspektren der dritten Fermentation die beiden Prozessgrößen zu berechnen. Gegenüber den Messwerten wurde für die Vorhersage des pH-Werts ein prozentualer Fehler bezogen auf den maximalen Messwert von 4,1 % berechnet. Der entsprechende Fehler der Vorhersage des Säuregrads lag bei 4,8 % (siehe Abb. 3).

Schlussfolgerung
Die Vorhersagen der Prozessgrößen Glucose-, Biotrockenmasse-, Ethanolkonzentration, pH-Wert und Säuregrad zeigen, dass die 2D-Fluoreszenzspektroskopie eine Methode darstellt, die zur Entwicklung von Sensoren für unterschiedliche Analyte geeignet ist. In den 2D-Fluoreszenzspektren ist eine große Datenredundanz erkennbar und nur ein geringer Teil der Wellenlängenkombinationen enthält die relevante Messinformation. Um einen Sensor für einen speziellen Prozess zu etablieren, müssen die entsprechenden informationstragenden Wellenlängenkombinationen für diesen ermittelt werden. Basierend auf entsprechenden Photodioden, LEDs und gegebenenfalls Filtern können Sensoren entwickelt werden, deren Kosten deutlich unter einem multifunktionalem Spektrometer liegen. In naher Zukunft ist zu erwarten, dass eine Vielzahl an speziellen Fluoreszenzsensoren für individuelle Anwendungen und Prozessanalysatoren entwickelt werden.

 

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