Isolierung von DNA für die Labordiagnostik

Automatisierte Aufreinigung von DNA aus Saatgut, Futter- und Lebensmitteln

  • Abb. 1: Weltweiter Anbau gentechnisch veränderter Pflanzen 2012 (nach [4])Abb. 1: Weltweiter Anbau gentechnisch veränderter Pflanzen 2012 (nach [4])
  • Abb. 1: Weltweiter Anbau gentechnisch veränderter Pflanzen 2012 (nach [4])
  • Abb. 2: Anwendung des Maxwell-Extraktionsautomaten zur Detektion gentechnisch veränderter Pflanzen (Bild: Promega; Patrick Gürtler)
  • Abb. 3: Vergleich der DNA-Konzentrationen verschiedener Matrices nach manueller Extraktion und automatisierter Extraktion mit dem Maxwell-Extraktionsautomaten.

Strikte Regulierungen, neue Gesetze und Lebensmittelskandale stellen Lebensmittelanalytiker vor eine große Herausforderung. Eine Vielzahl verschiedener Proben muss schnell und zuverlässig analysiert werden, um den hohen Qualitätsstandards in Deutschland und der Europäischen Union (EU) gerecht zu werden. Während DNA mittels PCR bereits automatisiert amplifiziert wird, mangelte es an einer automatisierten Isolierung des Erbguts. Dank der Entwicklung einer neuen Methode wird dies nun möglich.

Die sich häufenden Meldungen kontaminierter und falsch deklarierter Lebensmittel verunsichern den Verbraucher zunehmend und führen dazu, dass sich Konsumenten vermehrt kritisch mit der Herkunft und Qualität ihrer Lebensmittel auseinandersetzen. In den allermeisten Fällen jedoch, können sich die Kundensicher sein, dass die Produkte auf dem Weg zum Verbraucher ausgiebig getestet wurden. Berücksichtigt man, dass ein großer Supermarkt in Deutschland im Schnitt etwa 60.000 Lebensmittel anbietet, wird einem dabei aber schnell bewusst, vor welcher Herausforderung die Lebensmittelanalytik steht [1].

Allein das bayerische Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL Bayern) untersuchte 2012 insgesamt über 70.000 Proben, wovon neun Prozent (oder ca. 6.400 Proben) aufgrund Zusammensetzung oder falscher Kennzeichnung beanstandet wurden [2], gesundheitliche Risiken ergaben sich nur in einem äußerst geringen Prozentbereich. Immer häufiger werden deshalb für diese Analysen automatisierte und standardisierte Lösungen eingesetzt, da sie nicht nur Zeit sparen, sondern darüber hinaus eine gleichbleibend hohe Ergebnisqualität garantieren.

Automatisierte Isolierung von DNA aus Saatgut
In Europa unterliegen gentechnisch veränderte Pflanzen einer Zulassungs- und Kennzeichnungspflicht. Aktuell ist in der EU ausschließlich der Anbau zweier gentechnischveränderter Pflanzen erlaubt, wobei in Deutschland kein Anbau stattfindet. Nicht zugelassene gentechnischveränderte Organismen dürfen in der EU nicht auf den Markt gelangen (Nulltoleranz) [3]. Lebens- und Futtermittel mit Anteilen von mehr als 0,9 % an zugelassenen gentechnisch veränderten Bestandteilen sind kennzeichnungspflichtig.

Der jährlich wachsende Anteil an weltweit angebauten genmodifizierten Organismen führt zu einer steigenden Wahrscheinlichkeit, dass diese langfristig auch auf dem europäischen Markt auftauchen werden, weshalb eine strikte Überwachung von Lebens- und Futtermitteln, sowie Saatgut (Food, Feed and Seed (FFS) Produkte) in der EU durchgeführt wird. Das LGL Bayern entwickelte eine Methode zur automatisierten gDNA-Extraktion aus Saatgut, um den gestiegenen Arbeitsaufwand zu reduzieren.

Die bisher genutzte, manuelle „CTAB-basierte DNA Extraktion" gilt als etablierte Methode, um genomische DNA aus Saatgut, Futtermitteln und verschiedenen Lebensmitteln zu isolieren, da sich das im Puffer enthaltene Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) als optimaler Bestandteil zum chemischen Zellaufschluss bewährt hat. Doch im Gegensatz zur PCR Analyse, die zum Teil bereits automatisiert abläuft, war der CTAB-Puffer bisher mit automatisierten Aufreinigungs-Methodenin kompatibel und deshalb nicht automatisierbar. Aus diesem Grund wurde eine automatisierte CTAB-kompatible Methode zur DNA-Extraktion mit dem Maxwell 16-Gerät (Promega) entwickelt:

Dafür werden die Proben in CTAB-Puffer, RNase und Proteinase K für 90 Minuten inkubiert und anschließend zentrifugiert. Danach überführt man den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß, gibt Lysepuffer hinzu, bestückt den Extraktionsautomaten mit Elutionsröhrchen und Stößeln und startet die Aufreinigung. Nach der Elution kann die isolierte DNA direkt weiter verarbeitetoder bei -20°C gelagert werden. Im Vergleich zur manuellen Methode erreichte man für Maismehl, Sojamehl und gemahlene Rapssaat mit der automatisierten Extraktion bei allen getesteten Probenhöhere DNA Konzentrationen und einegute DNA-Reinheit [5] (Abb. 2).

Neue Gesetzgebung macht die Methode auch für Honig interessant
Bislang galt Pollen im Honig als Bestandteil des Honigs. Dies hat sich durch das Urteil des Europäischen Gerichtshofes vom 06.09.2011 geändert. Darin wird Pollen als Zutat im Honig definiert. Dies hat Folgen für die Analytik, da nun geprüft werden muss, ob der Honig Pollen von gentechnisch veränderten Pflanzenenthält [6]. Insbesondere wegen des geringen Pollen-Anteils im Honig stellt die DNA-Extraktion aus Pollen für die Molekularbiologen eine besondere Herausforderung dar. Honig selbst enthält außerdem Inhibitoren, die die PCR-Analysen nach der DNA-Extraktion hemmen können. Daher ist es sehr wichtig, eine effektive DNA-Aufreinigung durchzuführen, die mögliche Inhibitoren gut abtrennt.

Bisher wurde dazu die aufwendig emanuelle CTAB-Extraktion durchgeführt. Ähnlich wie beim Saatgut, wurde auch hier eine automatisierte, auf CTAB-basierende DNA-Extraktionsmethode für Honig entwickelt und validiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Isolierung mit dem Maxwell-FFS-Extraktionskit nicht nur Zeit spart, sondern auch vergleichbare DNA-Ausbeuten mit guter Reinheit erzielt werden (Abb. 2). In Kombination mit einem qPCR-Master Mix, der trotz PCR-Inhibitoren eine gute Amplifikation der DNA erlaubt, können gentechnisch veränderte Pollen sehr effektiv nachgewiesen werden. Diese Studie ist derzeit zur Publikation eingereicht.

Sortenreinheit von Fleisch mit der automatisierten Methode bestimmen
Im Februar 2013 verunsicherte die Entdeckung von Pferdefleisch in Lebensmitteln die Verbraucher. Um die falsch deklarierten Lebensmittel schnell und sicher zu identifizieren, war ein rasches Handeln der Lebensmittelanalytiker erforderlich. Ähnlich wie bei Saatgut und Honig ist eine Extraktion der DNA aus Fleischerzeugnissen schwierig und zeitaufwendig, weshalb überprüft wurde, ob sich die vorgestellte Methode auch für Fleischproben eignet. Erste Versuche zur Anwendung des FFS Extraktionskits zur Analytik von Fleisch- und Wurstwaren zeigten vergleichbare Ergebnisse mit anderen kommerziellen Extraktionsmethoden. Zur Verifikation der Daten werden derzeit weitere Analysen durchgeführt.

Zusammenfassung
Eine immer größer werdende Anzahl verschiedener Saatgut, Futter- und Lebensmittelproben muss regelmäßig auf ihre Qualität und auf mögliche Kontaminationen hin überprüft werden. Manuelle Methoden sind meist sehr zeit intensiv und der Erfolg hängt stark von der Erfahrung des Laborpersonals, dem angewandten Extraktionsverfahren sowie der Probenmatrix ab. Deshalb benötigt die Lebensmitteldiagnostik eine leicht reproduzierbare, einfache und effektive Methode, um der steigenden Anzahl an Proben gewachsen zu sein. Das LGL Bayern hat eine automatisierte, auf CTAB basierende DNA-Extraktionsmethode entwickelt, die Zeit spart und vergleichbare DNA-Mengen mit guter Reinheit liefert, die direkt weiterverarbeitet werden können.

Referenzen
[1] BMELV, Referat 311, Strategien der Lebensmittelsicherheit, 6 ff. (2013)
[2] LGL Bayern, LGL Jahresbericht 2012, 24 ff. (2013)
[3] BMELV, Lebensmittel und Gentechnik, 2 ff. (2013)
[4] James, C.: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops, ISAAA Brief No 44. (2012)
[5] Guertler, P.: European Food Research and Technology 236, 599-606 (2013)
[6] Jany, K.: Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit 7, 175-177 (2012)

 

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