LC-MS/MS-Multimethoden

  • Abb. 1: Gesamtionenchromatogramm der IFA-Multi-Klassenmethode im positiven Ionisierungsmodus: Abgebildet ist ein Kalibrierstandard des oberen Arbeitsbereiches für über 1.000 Verbindungen aus den Bereichen Mykotoxine, Pestizide, Arzneistoffe und Pflanzentoxine. Die y-Achse zeigt die Intensität gemessen in Counts, die x-Achse die Dauer eines chromatographischen Laufes, dargestellt in Minuten.
  • Abb. 2: Analyseschema der IFA-Multi-Klassenmethode für 1.400 Substanzen: Die Extraktion der Probe erfolgt in einem Verhältnis von 1:4. Die Lösungsmittelzusammensetzung eignet sich sowohl für die Extraktion von besonders polaren Substanzen wie Deoxynivalenol, als auch stark apolaren Substanzen wie Nigericin. Die Probenextrakte werden ohne weiteren Aufreinigungsschritt lediglich 1:1 verdünnt. Zur Verbesserung der Peakform der früh eluierenden Substanzen wird eine komplementäre Verdünnungslösung verwendet. Der verdünnte Extrakt wird anschließend in das LC-System überführt. Um eine maximale Robustheit des Systems zu erreichen wird eine HPLC Säule mit einem C18 Material verwendet. Das niedrige Injektionsvolumen von 5 µl sorgt in Kombination mit einer hohen Flussrate von 1 ml/min zu einer weiteren Verdünnung des Extraktes im LC-System und folglich zu einer Reduktion der Matrix-Effekte.
  • Abb. 3: Wiederfindungsraten und Extraktionseffizienzen für ein repräsentatives Set an Pestiziden (blau) und Mykotoxinen (orange) in Komplexfuttermitteln: Hohe Extraktionseffizienen zwischen 60 und 100 % verdeutlichen die Kompatibilität des Extraktionsverfahrens für unterschiedliche Substanzklassen in komplexen Matrizes, während Signalsuppression zu teilweise niedrigen numerischen Werten der scheinbaren Wiederfindung führt.

Aufgrund des steigenden öffentlichen Bewusstseins für den Bereich der Lebens- und Futtermittelsicherheit gewinnt die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln zunehmend an Bedeutung. Chromatographische Analysemethoden erlauben eine schnelle und verlässliche Auftrennung chemisch gleichartiger Substanzen in einer Großzahl an Matrices und repräsentieren den bevorzugten Lösungsweg im Bereich der Lebensmittelanalytik. Gegenwärtige Trends in der LC-MS/MS-Analytik verfolgen daher den Weg einer simultanen quantitativen Bestimmung einer hohen Anzahl an Zielanalyten aus unterschiedlichen Substanzklassen [1].

Einflussfaktoren wie klimatische Verhältnisse, Anbaupraktiken, Lagerbedingungen oder Verarbeitungsprozesse ermöglichen den Eintritt einer Reihe chemischer Schadstoffe in die Lebensmittelkette. Pflanzenkulturen werden durch den Einsatz von Pestiziden vor der Ausbreitung von Unkrautbefall unter Indoor- und Outdoor-Bedingungen kontrolliert. Pflanzenwachstumsregler finden eine immer breitere Anwendung zur Verbesserung von Produkteigenschaften wie Größe und Aussehen, um das Pflanzenwachstum anzuregen oder die Fruchtbildung zu stimulieren. In der globalen Fleischproduktion ist der Einsatz von Antibiotika zur Aufrechterhaltung der Tiergesundheit unumgänglich, was zu unerwünschten Rückständen dieser Substanzen in tierischen Produkten führt. Neben diesem anthrophogen negativen Beitrag zur Wertschöpfungskette können chemische Schadstoffquellen auch auf natürliche Art und Weise die Qualität und folglich die Sicherheit unserer Lebensmittel herabsetzen. Maßgebliche Vertreter dieser natürlichen Kontaminanten sind sekundäre Pilzmetabolite, besser bekannt als Mykotoxine, aber auch Pflanzentoxine wie zum Beispiel Pyrrolizidinalkaloide [2].
 
Lebensmittelanalytik im Wandel
Diese Schadstoffe sind im Untersuchungsumfang offizieller nationaler Kontrolllaboratorien enthalten, deren klassische LC-MS/MS-basierte Routinemethoden mit dem Ziel der maximalen Qualitätsausbeute der Analyseergebnisse konzipiert sind. Um den hohen Ansprüchen dieser staatlichen Kontrollorgane gerecht zu werden, verfolgten Prüfmethoden immer den Ansatz einer zielanalytspezifischen Extraktion gefolgt von einem für den Analyt maßgeschneiderten chromatographischen Trennkonzept.

Der stetige technische Fortschritt und die damit verbundene Weiterentwicklung chromatographischer Systeme sowie die Verbesserung der Sensitivität und Robustheit massenspektrometrischer Analysatoren sorgten für einen deutlichen Trend in Richtung simultaner Bestimmung einer Vielzahl von Analyten aus unterschiedlichen Substanzklassen. Durch das Festlegen von Rückstandshöchstwerten für hunderte Herbizide, Fungizide und Insektizide in diversen Lebensmittelgruppen sowie Trinkwasser wurden diese sogenannten Multimethoden erstmalig in der Pestizidanalytik etabliert [3]. Es folgten im Laufe der Zeit Multimethoden, die auch die simultane Quantifizierung anderer Substanzklassen wie Mykotoxine oder pharmakologischer Wirkstoffe erlaubten [4,5].

Um ein Gesamtbelastungsbild einer Lebensmittelprobe mit einem adäquaten Arbeitsaufwand und Ressourcenverbrauch zu gewährleisten, entwickelt sich der gegenwärtige Trend in Richtung sogenannter Multiklassenmethoden (Abb.1). Diese analytischen Spezialkonzepte erlauben jedoch nicht nur die simultane quantitative Bestimmung hunderter Zielanalyten aus unterschiedlichen Substanzklassen, sie führen die LC-MS/MS-Analytik auch an den Rand des Möglichen.
 
Herausforderungen in der Methodenentwicklung
Die Probenkomplexizität sowie die hohe physikochemische Diversität der Substanzen erschweren die umfassende Isolierung der Zielanalyten aus dem Probenmaterial. In der Pestizid- sowie Arzneistoffanalytik haben sich modifizierte Quechers (Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe)-Extraktionsmethoden in Kombination mit dispersiven Aufreinigungsverfahren durchgesetzt [6]. Neuere Probenvorbereitungsansätze zeigen jedoch die Anwendbarkeit generischer Extraktionsverfahren für die simultane Bestimmung von Mykotoxinen, Pestiziden, Pflanzentoxinen und Arzneimitteln. Im Gegensatz zu Quechers vermeiden diese unkomplizierten und geradlinigen Extraktionsprozesse das Prinzip der Phasentrennung und verzichten komplett auf einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt. Das einfache Verdünnen des Probenextraktes nach einer schnellen Fest-Flüssig-Extraktion ist ein Kompromiss in Sachen Arbeits- und Ressourcenaufwand sowie Extraktionseffizienz und Analysenqualität. Robuste und sensitive LC-MS/MS-Systeme (Abb.2) sind hierbei die Basis für routineorientierte Bestätigungsverfahren, um eine Systementgleisung durch interferierende Probenbestandteile aus dem unaufgereinigten Extrakt zu vermeiden [5,7]. Die Verdünnung des Extraktes stellt zudem die einzige effiziente Möglichkeit dar, um unerwünschte Einflüsse co-eluierender Matrixbestandteile auf die Zielanalyten zu reduzieren. Die entstehenden Suppressions- und Erhöhungseffekte entstehen im Rahmen des Ionisierungsprozesses und werden in Form absoluter Matrixeffekte ausgedrückt. Unterschiede der Response innerhalb verschiedener Replikate eines Matrixtyps werden als relative Matrixeffekte bezeichnet. Ohne effiziente Maßnahmen gegen diese Ionisierungsereignisse können absolute Matrixeffekte einen negativen Einfluss auf die Methodengenauigkeit und relative Matrixeffekte auf die Präzision ausüben [8,9].
 
Hohes Arbeitspensum
Diese Matrixeffekte können zwar in der Regel durch die Anwendung isotopenmarkierter interner Standards korrigiert werden, durch die hohe Anzahl an Verbindungen ist der routinemäßige Gebrauch interner Standards aufgrund des finanziellen Aufwandes und der limitierten Verfügbarkeit jedoch nicht Mittel der Wahl. Zudem stellen analytspezifische Aufreinigungsprozesse keine geeignete Option dar. Aufgrund der hohen natürlichen Kontaminationsrate durch biologische Schadstoffe ist eine Matrixkorrektur durch die Erstellung von Kalibrierstandards in der Zielmatrix nur limitiert anwendbar. Als Folge müssen diese Effekte im Zuge der Methodenvalidierung erfasst werden, um routinegenerierte Analyseergebnisse mittels Wiederfindungskorrektur dem wahren Wert anzugleichen. Die Autoren dieses Artikels entwickelten eine LC-MS/MS-basierte Multiklassenmethode (Abb. 1) für die simultane quantitative Bestimmung von über 1.400 Substanzen aus den Bereichen Mykotoxine, Pestizide, Pflanzentoxine und Arzneistoffe. Durch die Optimierung der Akquisitionsparameter wie der MS/MS-Zykluszeit und der analytspezifischen Retentionsfenster wurden trotz der großen Analytanzahl hohe Wiederholpräzisionen gewährleistet. Im Rahmen einer umfangreichen Vorvalidierungsphase wurden absolute und relative Matrixeffekte, Extraktionseffizienzen und Wiederfindungsraten in sechzehn Komplexfuttermitteln evaluiert. Die Experimente zur Ermittlung der analytischen Kenndaten wurden mit hohen Dotierungskonzentrationen durchgeführt, um die beschriebenen Effekte eindeutig zu isolieren. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Kompatibilität der unterschiedlichen Verbindungsklassen, sowohl mit dem gewählten Extraktionsverfahren, als auch den LC-MS/MS-Konditionen (Abb. 3).
 
Standardisierung von Validierungsschemen
Eine Limitierung dieser Verfahren zeigt sich hinsichtlich der Validierungsguidelines. Diese weisen unterschiedliche Anforderungskriterien auf und sollten diesbezüglich standardisiert werden. Substanzklassenübergreifende Akzeptanzkriterien betreffend absoluter und relativer Matrixeffekte, Extraktionseffizienzen und Wiederfindungsraten müssen zukünftig in Betracht gezogen werden.
 
Danksagung
Diese Arbeit wurde im Rahmen eines Forschungsvorhabens des Austrian Competence Centre for Feed and Food Quality, Safety and Innovation (FFoQSI) erstellt. Das Comet-K1 Kompetenzzentrum FFoQSI wird im Rahmen von Comet – Competence Centers for Excellent Technologies durch BMVIT, BMDW und die Bundesländer Niederösterreich, Oberösterreich und Wien gefördert. Das Programm Comet wird durch die FFG abgewickelt.
 
​Autoren
David Steiner1, Michael Sulyok2, Alexandra Malachová1, Rudolf Krska2
Zugehörigkeiten
1FFoQSI – Austrian Competence Centre for Feed and Food Quality, Safety & Innovation, Head Office: FFoQSI GmbH, Tulln, Österreich
2University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna (BOKU), Institute of Bioanalytics and Agro-Metabolomics, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), Tulln, Österreich
 
 
Kontakt
David Steiner

FFoQSI GmbH, Tulln, Österreich
david.steiner@ffoqsi.at

 

Schwerpunkt fortschrittliche Chromatographie

Literatur

[1]          Danezis et al. 2016. Food authentication: Techniques, trends & emerging approaches. http://dx.doi.org/10.1016/j.trac.2016.02.026

[2]          Danezis et al. 2016. Multi-residue analysis of pesticides, plant hormones, veterinary drugs and mycotoxins using HILIC chromatography e MS/MS in various food matrices. http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2016.09.011

[3]          Alder et al. 2006. Residue Analysis of 500 high priority pesticides: better by GC-MS or LC-MS/MS? https://doi.org/10.1002/mas.20091

[4]          Biselli et al. 2013. A multi-class, multi-analyte method for routine analysis of 84 veterinary drugs in chicken muscle using simple extraction and LC-MS/MS. https://doi.org/10.1080/19440049.2013.777976

[5]          Malachová et al. 2014. Optimization and validation of a quantitative liquidchromatography–tandem mass spectrometric method covering 295bacterial and fungal metabolites including all regulated mycotoxins infour model food matrices. http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2014.08.037

[6]          Anastassiades et al. 2003. Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and “Dispersive Solid-Phase Extraction” for the Determination of Pesticide Residues in Produce.

[7]          Mol et al. 2008. Toward a Generic Extraction Method for Simultaneous Determination of Pesticides, Mycotoxins, Plant Toxins, and Veterinary Drugs in Feed and Food Matrixes.  DOI: 10.1021/ac801557f

[8]          Matuszewski et al. 2006. Standard line slopes as a measure of a relative matrix effect in quantitative HPLC–MS bioanalysis
DOI: 10.1016/j.jchromb.2005.11.009

[9]          Niessen et al. 2006. Matrix Effects in Quantitative Pesticide Analysis using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. DOI 10.1002/mas.20097

Kontaktieren

FFoQSI GmbH, Tulln, Österreich


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