Lebensmittelanalytik

qPCR-basierter Speziesnachweis in Lebensmitteln

  • Abb. 1: Verschiedene Käsesorten; dargestellt sind die Signale des FAM-Kanals für den Nachweis von Rinder-, Ziegen- und Schaf-DNA, die Tabelle fasst die Ergebnisse noch einmal zusammen.Abb. 1: Verschiedene Käsesorten; dargestellt sind die Signale des FAM-Kanals für den Nachweis von Rinder-, Ziegen- und Schaf-DNA, die Tabelle fasst die Ergebnisse noch einmal zusammen.
  • Abb. 1: Verschiedene Käsesorten; dargestellt sind die Signale des FAM-Kanals für den Nachweis von Rinder-, Ziegen- und Schaf-DNA, die Tabelle fasst die Ergebnisse noch einmal zusammen.
  • Abb. 2: Sensitivität abhängig vom gewählten Zielgen; Amplifikationsblot (links): grün  Amplifikation des Cyt B-Gens, rot Amplifikation des GFAP-Gens, Zusammenfassung der Ergebnisse (rechts).
  • Abb. 3: Vergleich Extraktionsverfahren für Speziesnachweis; getestet wurden die Extraktion mit Magnetpartikeln (hellgrau), Silica-Säulen basierte Aufreinigung (rot) und die Aufreinigung basierend auf der PME-Technologie (dunkelgrau), links: Ausgangsmaterial Gelatinepulver, rechts: Ausgangsmaterial Halal-zertifizierte Gummibären.

Etwa 1800 neue Lebensmittel kommen jedes Jahr in die Supermarktregale. Hersteller und Kontrollbehörden stehen unter enormem Druck, diese Flut an Produkten auf ihre Inhaltsstoffe zu prüfen und für den Markt freizugeben [1]. Geschwindigkeit, Sensitivität und Genauigkeit sind wichtige Faktoren. Wie das funktionieren kann, zeigt eine auf quantitativer Real-Time-PCR (qPCR) basierende Lösung für den Speziesnachweis in Lebensmitteln.

Wissen Sie, was Sie essen? Verpackungsangaben sind oft irreführend und unvollständig. Transparenz und Richtigkeit der angegebenen Inhaltsstoffe sind jedoch wichtige Informationen für Verbraucher. Nicht nur Allergiker sind darauf angewiesen, sondern auch Menschen, die vegan oder vegetarisch leben oder aus religiösen Gründen bestimmte Dinge nicht verzehren. Die Lebensmittelindustrie betreibt großen Aufwand, um die Inhaltstoffe ihrer Produkte eindeutig zu bestimmen. Verkaufsfördernde, unabhängige Labels für Bioprodukte, glutenfreie, Halal- oder vegane Speisen erfordern hohe Transparenzstandards. Dennoch ist nicht immer drin, was drauf steht. Die folgenden Beispieluntersuchungen belegen das erneut. Vor allem prozessierte Lebensmittel stellen die Lebensmittelanalytik vor große Herausforderungen. Es bedarf besserer Methoden, um auch die kleinsten Mengen ungewünschter Bestandteile identifizieren zu können. Die neuen Analyseverfahren müssen dabei aber auch in der Lage sein, sich wirtschaftlich in Qualitätssicherungsprozesse zu integrieren. Eine Herausforderung für Unternehmen der Lebensmittelindustrie sowie der Analytik gleichermaßen [2].
Welche Fleischsorten stecken wirklich in einem Produkt? Woher kommt die Gelatine aus den Gummibären? Ist ein vegetarisches Produkt tatsächlich fleischfrei? qPCR klärt nicht nur diese Fragen, es klärt sie auch für stark prozessierte Lebensmittel wie Süßigkeiten oder Fertiggerichte schnell und präzise. Am Beispiel des Speziesnachweises in verschiedenen Käsesorten, Gelatinepuder und Halal-zertifizierten Gummibären soll hier demonstriert werden, dass mehr Transparenz nicht unbedingt mehr Komplexität bedeutet.

Von der Probe zum Ergebnis

Gute Nachweislösungen auf qPCR-Basis integrieren sich in die Qualitätsprozesse von Hersteller und Kontrollorganen und ergänzen bestehende Analyse-Methoden.

Sie optimieren nicht nur die Zeitabläufe, neu entwickelte und verbesserte Verfahren erhöhen auch die Sensitivität der Nachweise. Am Anfang einer Analyse steht die automatisierte Extraktion der DNA. Der manuelle Aufwand sollte sich dabei auf ein Minimum beschränken. Für die Probenvorbereitung für die hier vorgestellten Analysen wurde ein Gerät verwendet, das bis zu 16 Proben gleichzeitig prozessieren kann (Innupure C16 touch, Analytik Jena). Die Detektion erfolgte mit einem qPCR-System (qtower3, Analytik Jena).

Speziesnachweis in Käse

Käse gehört zu den stark prozessierten Lebensmitteln. Oft ist es ein langer Weg von der Milch zum Verkaufsprodukt. Bei industriell gefertigtem Käse kommen noch einmal weitere Schritte hinzu, was den Nachweis einzelner Inhaltsstoffe zusätzlich erschwert. Wie findet man also heraus, wo die Milch tatsächlich herkommt? Die Untersuchung von fünf Käsesorten aus Kuh-, Schafs- und Ziegenmilch soll das hier verdeutlichen.
Der erste Schritt ist die Nukleinsäure-Aufreinigung. Die Target-Amplifikation wurde im FAM-Channel nachgewiesen, die interne Kontrolle erfolgte im HEX-Channel. Das Ergebnis wird in diesem Verfahren in Form einer Positiv– oder Negativaussage wiedergegeben, eine Quantifizierung erfolgte nicht. Die Richtigkeit der Ergebnisse wurde anhand der mitgeführten Positivkontrolle und der internen Kontrolle verifiziert. Die interne Kontrolle ermöglichte neben der Analyse der Detektion zusätzlich eine Kontrolle der Extraktion. Die DNA von Rindern, Schafen und Ziegen wurde in drei Ansätzen parallel analysiert. Abbildung 1 zeigt die Analyse von fünf Käsesorten. Die Real-Time-PCR-Analyse zeigt, dass in allen Käsesorten, zusätzlich zu den angegebenen auch andere Milchsorten verwendet wurden. Lediglich für Probe 2 wurden die enthaltenen Milchsorten korrekt deklariert.

Fragmentierte DNA

Mit PCR-Verfahren lassen sich auch geringe Mengen von Tier-DNA nachweisen. Es gibt fertige Assay-Lösungen für viele gängige Fleisch- und Fischarten. Die verbesserte Sensitivität des qPCR-Nachweises wird durch die Amplifikation eines Multicopy-Gens erreicht. Die Wahl des richtigen Zielgens ist hier entscheidend. Abbildung 2 vergleicht die Amplifikation eines mitochondrialen- (grün) und genomischen (rot) Targets. Die Ergebnisse zeigen eine 100-fach erhöhte Sensitivität. Wie in der Tabelle ersichtlich, konnte bei einer DNA-Konzentration von 6 pg/µL lediglich das mitochondriale Gen (Cytochrom B – Cyt B), nicht aber das genomische Zielgen (glial fibrillary acidic protein – GFAP) nachgewiesen werden.
Ein weiteres Problem im Zusammenhang mit der Isolierung und Analyse von DNA, insbesondere aus stark prozessierten Lebensmitteln, besteht darin, dass die DNA oftmals sehr stark degradiert ist und nur in geringen Mengen vorkommt. Durch die Amplifikation kurzer spezifischer DNA-Fragmente, konnte jedoch bereits ein Schritt in die richtige Richtung gemacht werden. Zusätzlich verkompliziert schwer zugängliches Ausgangsmaterial, wie etwa Gelatine [3], die Analyse. Es gibt inzwischen aber auch für derartig schwierige Probenmaterialien Lösungen. Nach einer initialen Anreicherungsreaktion wird die DNA isoliert. Der Vorteil des Verfahrens basiert darauf, dass deutlich größere Mengen an Ausgangsmaterial für eine Extraktion eingesetzt werden können. Abbildung 3 illustriert eine vergleichende Analyse von Polymer Mediated Enrichment (PME, Analytik Jena), der Extraktion mit Magnetpartikeln sowie die Aufreinigung mit Silica-Säulen. Gelatinepulver und Halal-zertifizierte Gummibären wurden hier auf DNA von Schweinen und Rindern untersucht. Die Anreicherung von DNA spiegelt sich in verringerten Ct Werten als Ergebnis der qPCR wider, was in Abbildung 3 anhand einer reduzierten Balkenhöhe ersichtlich ist. Das Fehlen eines Balkens in Abbildung 3 Diagramm zeigt, dass die entsprechende DNA nicht nachgewiesen werden konnte. Für das Gelatinepulver konnte ausschließlich Schweine-DNA nachgewiesen werden. In den Halal-Gummibären hingegen finden sich DNA-Spuren beider Tierarten, was nicht den Halal-Vorschriften entspricht. Die klassischen Methoden haben hier jedoch versagt. Magnetpartikel-basierte Extraktion sowie die Säulenaufreinigung konnten keinen Nachweis erbringen. Lediglich die PME-Methode verfügte über die nötige Sensitivität, diese geringen Spuren zu detektieren.

Höhere Sensitivität

Die Beispiele zeigen, dass es schon heute möglich ist auch geringe Spuren von Inhaltstoffen präzise zu identifizieren. Auch prozessierte Lebensmittel mit stark fragmentierter DNA der tierischen Bestandteile, sind heute mit qPCR-Verfahren analysierbar. Die Probenvorbereitung, beziehungsweise die Anreicherung der Ziel-DNA aus bestimmten schwierig zu analysierenden Nahrungsmitteln, macht das möglich. Ein verbreiteter Einsatz dieser Technologie in der Analyse von Lebensmittel, kann in Zukunft dazu beitragen, mehr Transparenz gegenüber Verbrauchern zu schaffen und Kontrollmechanismen zu schärfen.

Autor
Eileen Brandenburger

Kontakt
Analytik Jena AG

Jena, Deutschland
info@analytik-jena.de

[1] BfR Authentizität.

[2] Pressemitteilung BfR: Fälschungen von Lebensmitteln tierischen Ursprungs künftig leichter nachweisbar.

[3] D. W. Babel, „Gelatine – ein vielseitiges Biopolymer,“ Chemie in unserer Zeit, pp. 86-95, 1996

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