Quo Vadis: PAKs in Lebensmitteln

Analytische Methoden und gesetzliche Höchstmengen

  • Abb. 2: GC-MS(Selected Ion Mode)-Chromatogramm eines Referenzmaterials bestehend aus 11 verschiedenen PAK dargestellt als Totalionenchromatogramm (A) mit drei deuterierten internen Standards (IS); Ionenspur m/z = 226 für Cyclopenta[cd]pyren (3); m/z = 228 für Benzo[a] anthracen (2), Triphenylen (4) und Chrysen (5) (siehe B); m/z = 252 für Benzo[b]fluoranthen (7), Benzo[k]fluoranthen (8), Benzo[j]fluoranthen (9), Benzo[e]pyren (10), Benzo[a]pyren (12) (siehe C) und Perylen (13) (A); m/z = 278 für Dibenzo[a,h]anthracen (14) (A); IS: m/z = 240 für [D12]-Benzo[a]anthracen (1) (siehe B); m/z = 264 für [D12]-Benzo[b] fluoranthen (6) und [D12]-Benzo[a]pyren (12) (siehe C); Verhältnis von Triphenylen : Chrysen = 1 : 1,5 und Benzo[b]fluoranthen : Benzo[k]fluoranthen : Benzo[j]fluoranthen = 1 : 0,77 : 1. Als GC-Kapillare wurde eine mit mittlerer Polarität, äquivalent zu (35 %-Phenyl)methylpolysiloxan, und mit Abmessungen von 30m x 0,25mm ID x 0,25 μm Filmdicke verwendet.Abb. 2: GC-MS(Selected Ion Mode)-Chromatogramm eines Referenzmaterials bestehend aus 11 verschiedenen PAK dargestellt als Totalionenchromatogramm (A) mit drei deuterierten internen Standards (IS); Ionenspur m/z = 226 für Cyclopenta[cd]pyren (3); m/z = 228 für Benzo[a] anthracen (2), Triphenylen (4) und Chrysen (5) (siehe B); m/z = 252 für Benzo[b]fluoranthen (7), Benzo[k]fluoranthen (8), Benzo[j]fluoranthen (9), Benzo[e]pyren (10), Benzo[a]pyren (12) (siehe C) und Perylen (13) (A); m/z = 278 für Dibenzo[a,h]anthracen (14) (A); IS: m/z = 240 für [D12]-Benzo[a]anthracen (1) (siehe B); m/z = 264 für [D12]-Benzo[b] fluoranthen (6) und [D12]-Benzo[a]pyren (12) (siehe C); Verhältnis von Triphenylen : Chrysen = 1 : 1,5 und Benzo[b]fluoranthen : Benzo[k]fluoranthen : Benzo[j]fluoranthen = 1 : 0,77 : 1. Als GC-Kapillare wurde eine mit mittlerer Polarität, äquivalent zu (35 %-Phenyl)methylpolysiloxan, und mit Abmessungen von 30m x 0,25mm ID x 0,25 μm Filmdicke verwendet.
  • Abb. 2: GC-MS(Selected Ion Mode)-Chromatogramm eines Referenzmaterials bestehend aus 11 verschiedenen PAK dargestellt als Totalionenchromatogramm (A) mit drei deuterierten internen Standards (IS); Ionenspur m/z = 226 für Cyclopenta[cd]pyren (3); m/z = 228 für Benzo[a] anthracen (2), Triphenylen (4) und Chrysen (5) (siehe B); m/z = 252 für Benzo[b]fluoranthen (7), Benzo[k]fluoranthen (8), Benzo[j]fluoranthen (9), Benzo[e]pyren (10), Benzo[a]pyren (12) (siehe C) und Perylen (13) (A); m/z = 278 für Dibenzo[a,h]anthracen (14) (A); IS: m/z = 240 für [D12]-Benzo[a]anthracen (1) (siehe B); m/z = 264 für [D12]-Benzo[b] fluoranthen (6) und [D12]-Benzo[a]pyren (12) (siehe C); Verhältnis von Triphenylen : Chrysen = 1 : 1,5 und Benzo[b]fluoranthen : Benzo[k]fluoranthen : Benzo[j]fluoranthen = 1 : 0,77 : 1. Als GC-Kapillare wurde eine mit mittlerer Polarität, äquivalent zu (35 %-Phenyl)methylpolysiloxan, und mit Abmessungen von 30m x 0,25mm ID x 0,25 μm Filmdicke verwendet.
  • Tab. 1: Die von der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) und von der amerikanischen Umweltbehörde (US EPA) als prioritär bewerteten PAK sowie die Bewertung ihrer Kanzerogenität durch die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) in Lyon.
  • Abb. 1: Flussdiagramm für eine „on-line“-Probenvorbereitung und Analyse von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstofen (PAK) in Speiseölen mittels einer DACC-HPLC mit Säulenschaltung; a) Position der Ventile für die Probenaufgabe auf die DACC-Anreicherungssäule; b) Position der Ventile für das Ausspülen der Matrix und Isopropanol aus der Anreicherungssäule im Rückfluss-Modus; c) Position der Ventile für die Elution der PAK auf die analytische Säule (DACC = Donor- Akzeptor-Komplexierungschromatographie).
  • Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Albrecht Seidel
  • Prof. Dr. Pablo Steinberg

Bei der Verarbeitung oder der Zubereitung von Lebensmitteln können gesundheitlich bedenkliche Begleitstoffe gebildet werden. Gesundheitsgefährdende Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) entstehen beispielsweise in Lebensmitteln vorrangig erst im Zuge einer Hitzebehandlung. Da PAK in der Regel nur in niedrigen Konzentrationen und als komplexe Gemische auftreten, sind leistungsfähige und spezifische analytische Methoden zu deren Bestimmung erforderlich.

Einleitung
Durch den täglichen Verzehr von Lebensmitteln nimmt der Mensch auch eine Vielzahl unerwünschter Begleitstoffe auf, wenn auch überwiegend in sehr niedrigen Konzentrationen. Die Bewertung und Kontrolle solcher Stoffe in Lebensmitteln ist eine permanente Herausforderung für die damit befassten Kommissionen und die Überwachungslaboratorien. Kontaminanten von Lebensmitteln können aus der Umwelt stammen (z.B. Mykotoxine, PAK), aber auch erst während der Verarbeitung entstehen (z.B. Acrylamid, Acrolein, PAK) [1]. In Anbetracht der Vielfalt dieser Stoffe und der häufig im niedrigen ppb-Bereich liegenden Konzentrationen ist eine Kontrolle in Lebensmitteln nur durch leistungsfähige und spezifische analytische Methoden zu gewährleisten. Für PAK sind in der Europäischen Union seit 2012 neue Regelungen für Grenzwerte in verschiedenen Lebensmitteln in Kraft getreten.

Entstehung und Vorkommen in Lebensmitteln
PAK entstehen durch Pyrolyse und unvollständige Verbrennungsprozesse organischen Materials, wie z.B. fossiler Brennstoffe (Kohle, Benzin, Heizöl), Holz (Kaminfeuer) und Tabak, und gelangen mit den Verbrennungsgasen als Schadstoffe in die Umwelt [2]. PAK beanspruchen großes gesundheitspolitisches Interesse, da zahlreiche Vertreter dieser Stoffgruppe nach Verstoffwechselung eine mutagene und kanzerogene Wirkung aufweisen [3]. PAK sind als luftgetragene Umweltschadstoffe an feine Staubpartikel gebunden und treten in der Regel als komplexe Gemische von mehr als 100 Komponenten auf.

Typische Kontaminationen mit PAK aus der Umwelt können bei großblättrigem Gemüse wie beispielsweise Grünkohl auftreten, die durch Ablagerungen von Staubpartikeln verursacht werden, sowie bei Miesmuscheln aus belasteten Küstengewässern, wobei PAK-haltige Sedimente und Mineralölrückstände die Ursache sind. In Industrieländern mit hohen Umweltstandards sind technische Verarbeitungsprozesse die bedeutendere Ursache für PAK-Belastungen von Lebensmitteln. Der direkte Kontakt mit Rauchgasen bei Trocknungsvorgängen, die Konservierung und Zubereitung von Fleisch und Fisch durch herkömmliches Räuchern bzw. Grillen sowie Rösten bestimmter Produkte kommen als Quellen für eine PAK-Belastung in Frage. So werden PAK beispielsweise in manchen Teesorten, geröstetem Kaffee, Kakaobutter und konventionell geräuchertem Käse, Fleisch- und Wurstwaren sowie in konventionell gegrilltem Fleisch mit hohem Fettgehalt nachgewiesen. Kommerziell erhältliche Lebensmittel unterliegen den gesetzlichen Höchstmengenregelungen für PAK der Europäischen Union (siehe Abschnitt Gesetzliche Regelungen in der EU). Nichtsdestotrotz ist die Allgemeinbevölkerung einer dauerhaften Exposition gegenüber PAK ausgesetzt, wobei überwiegend niedrig belastete Lebensmittel und Tabakrauch als die wichtigsten Quellen gelten.

PAK4 als Indikator einer Kontamination
Basierend auf dem Vorkommen und der kanzerogenen Wirkung hat die amerikanische Umweltbehörde (US EPA) bereits in den 1970iger Jahren eine Liste von 16 prioritären PAK zur Bewertung einer PAK-Belastung festgelegt (Tab. 1). Das Benzo[a]pyren wurde dabei als Leitverbindung herangezogen, das die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) der WHO im Jahr 2005 als humanes Kanzerogen in die Gruppe 1 hochgestuft hat. Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) hat dagegen in ihrer Liste von (15 +1) prioritären PAK [4] zur Bewertung von PAK in Lebensmitteln nur PAK mit kanzerogener Wirkung berücksichtigt. Nach Auswertung einer umfangreichen Datenbank zu PAK-Gehalten in verschiedenen Lebensmittelgruppen hat die EFSA Benzo[a]pyren als ausschließliche Leitkomponente für die Bewertung verworfen und neben der Bestimmung des Benzo[a]pyren seinen Summenparameter PAK4, bestehend aus Benzo[a]pyren, Benzo[a]anthracen, Chrysen und Benzo[b]fluoranthen, zur Bewertung vorgeschlagen, der seitens der Europäischen Kommission in eine neue Verordnung umgesetzt wurde. Die korrekte Bestimmung von PAK4 und der (15 +1)-EFSA-PAK stellt hohe Anforderungen an die instrumentelle Analytik.

Analytik in Lebensmitteln
Die erhebliche Bandbreite der verschiedenen Lebensmittelproben erfordert generell für die Bestimmung der PAK eine jeweils angepasste, zum Teil sehr zeitintensive Probenvorbereitung vor der abschließenden Quantifizierungmittels instrumenteller Analytik. Die akkurate Bestimmung der PAK4 und der (15+1) EFSAPAK stehen derzeit besonders im Blickpunkt. In den Laboratorien der amtlichen Überwachung,wie auch der freien Anbieter wird zur Quantifizierung der PAK4 überwiegend die HPLC mit Fluoreszenzdetektor (FD) oder die GC-MS im „Selected-Ion-Monitoring"(SIM)-Modus eingesetzt.

Durch die Abtrennung der zum Teil komplexen Matrixbestandteile der Lebensmittelproben und die Wahl der Probengröße wird die Empfindlichkeit der Analytik erheblich verbessert. Dabei wird die Bestimmungsgrenze maßgeblich durch die Probengröße bestimmt. So werden beispielsweise Fleischproben zunächst mit methanolischer KOH verseift [5]. Anschließend können die PAK mit Cyclohexan extrahiert werden. Bei der Untersuchung von Obst- und Gemüseproben erweist sich eine Soxhlet-Extraktion mit Toluol als ein geeignetes Verfahren, während beispielsweise Pflanzenöle anstelle einer initialen Verseifung auch direkt in Cyclohex angelöst werden können. Auch eine beschleunigte Lösungsmittelextraktion, die unter Druck und bei erhöhter Temperatur stattfindet, kann zur Extraktion von PAK aus Fleischproben eingesetzt werden [6]. Das weitere „clean-up" richtet sich nach der entsprechenden Matrix und kann aus einer flüssig-flüssig Extraktion, einer automatisierbaren Gelpermeationschromatographie oder speziellen Festphasenextraktionen (SPE, „solid phase extractions") bestehen [7]. Bei in Cyclohex angelösten Pflanzenölen ermöglicht eine Komplexierung mit Koffein eine rasche Anreicherung in der wässrigen Phase, aus der die PAK nach Zersetzung ihrer Koffein-Komplexe wieder mit Cyclohexan extrahiert werden können.

Die meistens sehr guten Fluoreszenzeigenschaften der PAK ermöglichen eine Quantifizierungmittels HPLC-FD mit ausgezeichneter Empfindlichkeit. Eine zusätzliche Absicherung der strukturellen Zuordnung der individuellen PAK kann durch eine Tandem-Anordung von FD und Dioden-Array-Detektor (DAD) erzielt werden, was einen Vergleich der UV-Spektren mit einer Bibliothek erlaubt. Als eine besonders attraktive Anwendungerscheint die Donor-Akzeptor-Komplex-Chromatographie (DACC) gekoppelt mit einer HPLC-FD-Analyse, welche in der Hochdurchsatzanalytik bei Pflanzenölen eingesetzt wird [8]. Als stationäre Phase bei der DACC kann z. B. ein Tetrachlorophthalimidopropyl(TCP)-modifiziertes Kieselgel verwendet werden [7]. Die automatisierbare Methode läuft in drei Schritten mit einer komplexen Säulenschaltung ab (Abb. 1). Zunächst werden die PAK aus der Pflanzenölprobe auf der DACC-Säule angereichert (Abb. 1, a) und von der Matrix durch deren Rückwärtsspülen abgetrennt (Abb.1, b). In einem dritten Schritt wird das PAK-Gemisch von der DACC-Säule rückwärts eluiert und an der nachgeschalteten HPLC-FD-Säule getrennt und quantifiziert (Abb. 1, c).

Einige Einschränkungen bei der PAK-Bestimmung mittels HPLC-FD sind jedoch erwähnenswert. Während die PAK4 prinzipiell empfindlich genug quantifizierbar sind, lässt sich von den (15 +1) EFSA-PAK das Cyclopenta[cd]pyren aufgrund seiner schwachen Fluoreszenz nicht mit ausreichender Empfindlichkeit bestimmen, wobei auch eine Kombination mit einem UV-DAD keine entscheidende Verbesserung bringt. Auch wenn die Anregungs- und Emissions-Wellenlängen auf die einzelnen PAK optimiert werden können, neigt die HPLC-FD-Methode zu „falsch zu hohen" Werten, da eine Interferenz mit verbleibenden Matrixbestandteilen grundsätzlich nicht auszuschließen ist. Auch eine zusätzliche Charakterisierung mittels DAD zeigt in der Praxis nicht selten nur eine mäßige Übereinstimmung mit den UV-Referenzspektren aus der Bibliothek. Hinzu kommt eine um einen Faktor 20 - 30 niedrigere Bestimmungsgrenze im Vergleich zur Quantifizierung mittels FD.

Quantifizierung durch GC-MS/MS
Die Analytik von PAK4 und der (15 +1) EFSAPAK mittels GC-MS im SIM-Modus nach dem Stabil-Isotopen-Verdünnungsprinzip erlaubt eine selektive und spezifische Quantifizierung mit überwiegend zu vernachlässigenden Matrixeffekten bis in den sub-ppb-Bereich. Allerdings müssen die eingesetzten GC-Kapillaren bestimmte Anforderungen erfüllen, die bei der Bestimmung der PAK4 und (15 +1) EFSA-PAK eine entscheidende Rolle spielen. Insbesondere müssen eine ausreichende Isomerentrennung von Triphenylen und Chrysen sowie die Trennung der drei isomeren Benzofluoranthene gewährleistet sein (Abb. 2). Triphenylen muß zwar nicht quantifiziert werden, kommt aber als Komponente in nativen Lebensmittelproben vergesellschaftet mit Chrysen vor, jedoch nicht in konstanten Verhältnissen. Zur Bestimmung der PAK4 werden einige Kapillaren gezielt angeboten, welche beide Trennprobleme lösen. Dies wird durch eine längere Kapillare und eine sehr dünne Filmdicke der Flüssigphase erreicht, was allerdings eine verringerte Kapazität der Kapillare zur Folge hat. Nicht immer ist bei diesen Kapillaren auch eine ausreichend gute Selektivität im Bereich der PAK mit höheren Molekulargewichten gegeben. Wie die Abbildung 2 zeigt, lassen sich die oben angesprochenen Trennungen auch auf einer üblichen für die PAK-Analytik geeigneten Kapillare mittlerer Polarität durch angepasste Bedingungen in ausreichendem Maß erreichen. Die GC-MS wird in Hochdurchsatz-Anwendungen in Kombination mit einer „on-line"-Festphasenextraktion (SPEGC-MS) zur Analyse verschiedener Lebensmittelproben eingesetzt [9].

Gesetzliche Regelungen in der EU
In der Verordnung (EU) 835/2011 wurden neue Höchstgehalte für Benzo[a]pyren und für die Summe PAK 4 in Lebensmitteln festgelegt (Tab. 2, siehe http://bit.ly/QuoVadis-GIT0913) [10]. Die Verordnung sieht eine Absenkung von Höchstgehalten für einige bereits existierende Warengruppen, z. T. versehen mit bestimmten Übergangsfristen, vor. Zusätzlich wurden Höchstgehalte für wärmebehandeltes Fleisch und wärmebehandelte Fleischerzeugnisse sowie für Kakaobohnen und Folgeerzeugnisse festgesetzt.

Direktes Räuchern wird derzeit zunehmend durch die Anwendung von Flüssigraucharomen ersetzt. Der für Flüssigraucharomen nochzulässige Gehalt an PAK ist europaweit durch die Verordnung (EG) 2065/2003 geregelt [11]. Es dürfen nur Raucharomen mit einem maximalen Gehalt von 10 μg/kg Benzo[a]pyren und 20 μg/kg Benzo[a]anthracen zur Anwendung kommen. In dem mit Raucharomen versetzten Lebensmittelerzeugnis darf der Gehalt an Benzo[a]pyren 0,03μg/kg nicht überschreiten.

In der Verordnung (EU) 231/2012 wurden Höchstgehalte für Benzo[a]pyren in den Lebensmittelzusatzstoffen E 153 (Pflanzenkohle) und E 905 (mikrokristallines Wachs) festgelegt [12]. Für beide Zusatzstoffe gilt ein Benzo[a]pyren-Grenzwertvon 50 μg/kg, der sich beim Wachs direkt auf das Produkt bezieht, bei der Pflanzenkohle jedoch auf einen herzustellenden Cyclohexanextrakt.

Fazit
PAK sind als Kontaminanten in Lebensmitteln lange bekannt. Der in der Europäischen Union neu eingeführte Summenparameter PAK 4 zur Bewertung einer PAK-Belastung von Lebensmitteln sowie die Bestimmung der EFSA-PAK haben inder letzten Dekade starke Impulse zur Weiterentwicklung der PAK-Profilanalyse gesetzt. Zur Bestimmung von PAK 4 inbestimmten Lebensmittelproben stehen heute zum Teil vollautomatisierte Hochdurchsatz-Analyseverfahrenzur Verfügung.

Literatur
[1] Seidel A. und Steinberg P.: GIT Labor-Fachzeitschrift, 57, 231-233 (2013)
[2] Jacob J. und Seidel A.: GIT Labor-Fachzeitschrift, 44, 570-573 (2000)
[3] Seidel A. et al.: BIOforum, 23, (2000)
[4] Wenzl T. et al.: Trends in Analytical Chemistry, 25, 716-725 (2006)
[5] Grimmer G. and Böhnke H.: J Assoc Off Anal Chem, 58, 725-733 (1975)
[6] Jira W. et al.: Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 25, 704-713 (2008)
[7] Moret S. und Conte L. S.: J Chromatogr A, 882, 245-253 (2000)

Weitere Literaturbei den Autoren erhältlich. 

Mehr Informationen zum Thema

http://bit.ly/GIT-GCMS

Lebenslauf
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Albrecht Seidel
Ist seit 1999 Vorstand und Geschäftsführer der Biochemisches Institut für Umweltcarcinogene, Prof. Dr.Gernot Grimmer-Stiftung in Großhansdorf. Er lehrt im Bereich Toxikologie an der Charité Berlin und an der Universität Potsdam.

2000 Habilitation in Toxikologie (Uniklinikum der JOGU Mainz) „Mechanistische Untersuchungen zur Mutagenität von Fjord-Region-Dihydrodiolepoxiden polycyclischeraromatischer Kohlenwasserstoffe"

1989 Promotion in Chemie (Johannes Gutenberg-Universität Mainz) „Die selektive Synthese von potentiellen Metaboliten polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe mit vorfunktionalisierten Bausteinen"

1979 Hauptdiplomabschluss

1972-1978 Dipl.-Studium der Chemie (Johannes Gutenberg-Universität Mainz)

Lebenslauf
Prof. Dr. Pablo Steinberg

Ist seit 2008 Professor für Lebensmitteltoxikologie und Ersatz-/Ergänzungsmethoden zum Tierversuch und Direktor des Instituts für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover). Von 1998 bis 2008 war er Professor für Ernährungstoxikologie an der Universität Potsdam.

1996 Stipendiat im Rahmen des modifizierten Heisenberg-Programms der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Universität Mainz)

1994 Habilitation (Universität Mainz) „Tumorvorläuferzellenin der Leber: Untersuchungen zur Rolle von ovalen Zellen in der Entstehung epithelialer Lebertumoren"

1993 Wissenschaftlicher Assistent (Universität Mainz)

1988 Wissenschaftlicher Angestellter (Universität Mainz)
1986 Stipendiat der Alexander von Humboldt-Stiftung (Universität Mainz)

1985 Promotion (Universität Buenos Aires) „Effekte des Diuretikums Triamteren auf katecholaminerge und serotoninerge Systeme der Ratte"

1982 Diplom

1976-1982 Studium der Biochemie (Universität Buenos Aires)

Autor(en)

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Prof. Dr. Grimmer- Stiftung
Lurup 4
22927 Großhansdorf
Telefon: 04102/62155
Telefax: 04102/63028

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