Schnelle Bestimmung von Zuckern

Lebensnotwendig, statt nur Dickmacher

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des Analysen-Workflows. Der Wechsel von „regenerieren“ auf „äquilibrieren“ besteht aus einem Stufengradienten von hohen zu kleineren NaOH-Konzentrationen.Abb. 1: Schematische Darstellung des Analysen-Workflows. Der Wechsel von „regenerieren“ auf „äquilibrieren“ besteht aus einem Stufengradienten von hohen zu kleineren NaOH-Konzentrationen.
  • Abb. 1: Schematische Darstellung des Analysen-Workflows. Der Wechsel von „regenerieren“ auf „äquilibrieren“ besteht aus einem Stufengradienten von hohen zu kleineren NaOH-Konzentrationen.
  • Abb. 2: Beispielchromatogramm für die Trennung der Zuckerstandards auf der Carbopac PA20 Säule.
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  • Tab. 2: Ergebnisse der Wiederholbarkeitsmessungen mit und ohne Arabinose als internem Standard

Zuckersüß und allgegenwärtig - der Bestimmung von Zuckern und Kohlenhydraten kommt in der Lebensmittelanalytik eine besonders große Bedeutung zu. Die Ionenchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion ist für die Routineanalytik von Zuckern eine gut etablierte Alternative zur klassischen Brechungsindexdetektion. Mit Dual-Stream-Systemen kann hierbei der Probendurchsatz deutlich erhöht und somit eine bessere Geräteauslastung erzielt werden.

Zucker sind Polyhydroxy-Carbonylverbindungen mit mindestens drei Kohlenstoffatomen, die eine Carbonylgruppe und mindestens zwei Hydroxygruppen besitzen. In den Medien oft eindimensional als Dickmacher verschrien, sind Zucker für uns doch lebensnotwendig. Als wichtige Energielieferanten für den menschlichen Körper versorgen sie Muskeln und Gehirn mit der nötigen Energie. Als Zucker im engeren Sinne gelten Verbindungen, die aus einem oder mehreren Kohlenhydratmolekülen oder Sacchariden bestehen. Monosaccharide oder Einfachzucker umfassen dabei Verbindungen wie Glucose oder Fructose. Der gewöhnliche Haushaltszucker Sucrose und der Milchzucker Lactose zählen beispielsweise zu den Disacchariden und bestehen aus zwei Zuckereinheiten.

Die Zuckergehalte in Lebensmitteln zu bestimmen, ist für eine korrekte Deklaration der Nährwerte notwendig. Ein weiterer Grund liegt in der wachsenden Anzahl von Menschen mit Unverträglichkeiten, wodurch auch die Nachfrage nach Produkten steigt, die frei von bestimmten Zuckern, z. B. Lactose, sind. Die einfache und schnelle Analyse von Zuckern ist daher ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln.

Analytische Bestimmung von Zuckern

Um Zucker zu bestimmen, gibt es unterschiedlichste Methoden, von einfachen Farbreaktionen zum qualitativen Nachweis bis hin zu komplexen chromatographischen Trennverfahren mit massenspektrometrischer Detektion. Doch gerade die Analyse komplexer Mischungen von Kohlenhydraten ist eine analytische Herausforderung.

Farbreaktionen können lediglich die generelle Anwesenheit von Zuckern aufzeigen, und massenspektrometrische Detektionen verursachen hohe Betriebskosten und erfordern gut ausgebildetes, spezialisiertes Personal.

Die Bestimmung mittels Hochleistungs-Anionenaustauscher-Chromatographie kann daher eine gute Alternative sein.

In alkalischen mobilen Phasen werden die Zucker dabei anhand ihrer unterschiedlichen pKa-Werte auf Chromatographiesäulen mit positiv geladenen, starken Anionenaustauschern aufgetrennt. Neben der Chromatographie ist aber auch die Detektion eine Herausforderung.

Die gängigste Detektionsart in der Flüssigchromatographie, die spektrophotometrische Detektion über UV-Absorption oder Fluoreszenz, scheidet bei Zuckern aus, da sie über keine optisch aktiven funktionellen Gruppen verfügen. Die Detektion über den Brechungsindex ist ebenfalls nur bedingt tauglich, da diese Detektoren nicht für den Gradientenbetrieb geeignet und nur begrenzt nachweisstark sind. Eine mögliche Nachsäulenderivatisierung würde die Komponenten zwar für spektrophotometrische Detektionsarten zugänglich machen, aber diese zusätzlichen Arbeitsschritte sind ihrerseits anfällig für Fehler und erhöhen den Zeitaufwand.

HPAEC-PAD als zuverlässige Analysentechnik

Die elektrochemische Aktivität der Zucker bietet hier allerdings eine andere Möglichkeit der Detektion. Die Kombination aus Hochleistungs-Anionenaustauscher-Chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion (pulsed amperometric detection, PAD), ermöglicht eine empfindliche Bestimmung von Zuckern bei hoher chromatographischer Auflösung. Durch langwierige Regenerations- und Äquilibirierungszeiten liegt bei konventionellen Methoden die Analysendauer oft bei einer Stunde oder mehr, obwohl die eigentliche chromatographische Trennung innerhalb einer deutlich kürzeren Zeit abgeschlossen wird.

Lange Regenerations- und Äquilibrierungsschritte sind notwendig, um Einflüsse von Kohlendioxid aus der Umgebungsluft zu vermindern. Das Kohlendioxid reagiert dabei mit Natriumhydroxid aus der mobilen Phase und beeinflusst so die Retention der Analyten. Die dabei entstehenden Carbonat-Ionen können sich entlang der Säule akkumulieren und besetzen dabei die aktiven Stellen der Säule. Sie verhindern somit die Wechselwirkungen der Zucker mit der stationären Phase. So verringern sich über eine längere Betriebszeit hinweg die Retention und damit auch die Auflösung und Reproduzierbarkeit. Um dies zu verhindern, muss nach einem Lauf für eine längere Zeit mit hohen NaOH-Konzentrationen gespült werden.

Dual-Stream-Systeme

Um dieses Problem zu verringern, ist es möglich, sogenannte Dual-Stream-Systeme einzusetzen. Hierbei werden in einem System zwei chromatographische Säulen verwendet und zwischen Äquilibrierung und Analyse hin- und her geschaltet. Während auf der einen Säule gerade die Analyse stattfindet, wird die andere gespült und äquilibriert. Nach dem Lauf werden dann beide Säulen einfach getauscht. So entfällt die lange Wartezeit und die Analysendauer lässt sich um etwa die Hälfte reduzieren (Abb. 1).

Für eine Analyse zum konzeptionellen Beweis der Eignung dieses Setups für die Zuckeranalytik, wurde ein HPLC-System (Prominence, Shimadzu), ausgestattet mit einem 10-Position-2-Wege-Ventil, in Kombination mit einem elektrochemischen Detektor (Decade Elite, Antec) verwendet. Die analytischen Trennbedingungen sind in
Tabelle 1 dargestellt.

Trotz der Äquilibrierungszeit ist auch im Analyse-Kanal eine kurze anfängliche Äquilibrierung von fünf Minuten notwendig, um eine stabile Basislinie zu erzeugen, da der PAD-Detektor schon auf geringe Änderungen des Laufmittels oder Rückdrucks sehr empfindlich reagiert. Um den Druckunterschied zwischen den beiden Säulen möglichst zu minimieren, wurde zusätzlich eine 10 cm PEEK-Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,003“ verwendet.

Analyse von Zuckerstandards

Für die Analyse wurde ein Standardgemisch von Arabinose, Galactose, Glucose und Xylose in Wasser verwendet. Die Konzentration der Standards betrug dabei jeweils 1 mmol/L. Ein Beispielchromatogramm ist in Abbildung 2 dargestellt. Um die Robustheit des Setups und der Methode zu testen, wurden 26 konsekutive Messungen durchgeführt, jeweils 13 auf jeder Säule. Dabei zeigte sich eine sehr gute Retentionszeitstabilität mit Standardabweichungen (RSD) von < 0,06% (siehe Tabelle 2).

Für die Peakflächen zeigte sich im Laufe der Messungen eine Abnahme durch Ablagerungen an der Elektrode. Um diese Verluste auszugleichen ohne weitere Spül- oder Regenerationsschritte des Detektors einzuführen, kann die Kalibration über einen internen Standard erfolgen. Wird zum Beispiel die Arabinose als interner Standard für die Kalibration der übrigen Zucker verwendet, kann die relative Standardabweichung der Peakflächen der Zucker um den Faktor Vier reduziert werden.

Fazit

Die Hochleistungs-Anoinenaustauscher-Chromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion ist eine effektive Methode zur Bestimmung von Kohlenhydraten. Allerdings weist sie bei einem konventionellen Betrieb eine lange Analysendauer auf. Durch den Einsatz eines Dual-Stream-Systems kann die Analysenzeit, verglichen mit einer Standardkonfiguration, deutlich verkürzt werden. Die beobachtete Alterung der Elektrode kann dabei durch die Verwendung interner Standards oder einem zusätzlichen Regenerationsschritt des Detektors in weiteren Schritten zusätzlich optimiert werden.

Autorin
Isabelle Spenner

Kontakt 
Dr. Isabelle Spenner
Produktspezialistin HPLC
Shimadzu Deutschland GmbH
Duisburg, Deutschland
info@shimadzu.de

Methodenübersicht Zuckeranalytik

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