3Cs-Technologie zur Produktion von sgRNA-Bibliotheken

CRISPR/Cas-Screening in bislang ungekannter Diversität und Qualität

  • Abb. 1: 3Cs-Technologie. Ein doppelsträngiges lentivirales Ausgangsplasmid wird mit Hilfe von M13K07-Bakteriophagen in einen Einzelstrang überführt (einzelner grauer Kreis), an das sgRNA-kodierende DNA-Oligonukleotide (oranger Pfeil) hybridisiert werden. Die DNA-Oligonukleotide werden verlängert, sodass eine Heteroduplex-DNA entsteht, von der in Bakterien nur der neu-synthetisierte Strang (oranger Kreis) amplifiziert wird. Adapted from Wegner et al., eLife, 2019. Abb. 1: 3Cs-Technologie. Ein doppelsträngiges lentivirales Ausgangsplasmid wird mit Hilfe von M13K07-Bakteriophagen in einen Einzelstrang überführt (einzelner grauer Kreis), an das sgRNA-kodierende DNA-Oligonukleotide (oranger Pfeil) hybridisiert werden. Die DNA-Oligonukleotide werden verlängert, sodass eine Heteroduplex-DNA entsteht, von der in Bakterien nur der neu-synthetisierte Strang (oranger Kreis) amplifiziert wird. Adapted from Wegner et al., eLife, 2019.
  • Abb. 1: 3Cs-Technologie. Ein doppelsträngiges lentivirales Ausgangsplasmid wird mit Hilfe von M13K07-Bakteriophagen in einen Einzelstrang überführt (einzelner grauer Kreis), an das sgRNA-kodierende DNA-Oligonukleotide (oranger Pfeil) hybridisiert werden. Die DNA-Oligonukleotide werden verlängert, sodass eine Heteroduplex-DNA entsteht, von der in Bakterien nur der neu-synthetisierte Strang (oranger Kreis) amplifiziert wird. Adapted from Wegner et al., eLife, 2019.
  • Abb. 2: Die 3Cs-Technologie entkoppelt Diversität und Verteilung. A) DNA-Oligonukleotide mit zufälligen Positionen (oranges „N“) wurden generiert, um sgRNA-Bibliotheken mit ansteigender Diversität zu erzeugen. B) NGS-basierte Qualitätskontrolle aller erzeugten sgRNA-Bibliotheken bestätigen, dass mittels der 3Cs-Technologie Diversität und Verteilung entkoppelt werden.  Adapted from Wegner et al., eLife, 2019.
Die CRISPR / Cas-Technologie hat die medizinische Grundlagenforschung revolutioniert, in vielen Labors werden genomweite sgRNA-Bibliotheken zum Hochdurchsatz-Screening verwendet. Bislang wurde von diesen Reagenzien jedoch üblicherweise nur das kodierende Genom erfasst. Mit der 3Cs-Technologie steht nun eine Methode zur Verfügung, mit der auch sehr große sgRNA-Bibliotheken zur Analyse nicht-kodierender Bereiche in exzellenter Qualität hergestellt werden können.
Die CRISPR/Cas-Technologie verwendet bakterielle Enzyme, CRISPR-assoziierte (Cas)-Nukleasen, um DNA an definierten Positionen zu schneiden. Hieraus ergeben sich vielfältige Möglichkeiten – im einfachsten Fall führt der Schnitt zu einem Ausfall der entsprechenden Genfunktion. Ihre Treffsicherheit erlangen Cas-Enzyme durch die Bindung eines RNA-Oligonukleotids (single guide RNA, sgRNA), mit dessen Hilfe sie an eine komplementäre Sequenz im Genom geführt werden. Durch die Produktion sogenannter sgRNA-Bibliotheken, in denen multiple sgRNA-Sequenzen vertreten sind, lassen sich in Hochdurchsatzexperimenten zahlreiche Genotyp-Phänotyp-Beziehungen parallel evaluieren („Screening“). Screens können in verschiedenen Formaten angesetzt werden. Im „Array-Format“ sind die einzelnen sgRNAs physikalisch voneinander getrennt, daher ist die Auswertung je nach Größe der sgRNA-Bibliothek mit enormem Arbeitsaufwand verbunden und bedarf automatisierter Lösungen. Einfacher sind sogenannte „pooled“ Screenings, bei denen alle sgRNAs in einem Ansatz vermischt vorliegen [1,2]. Benötigt werden hierfür sgRNA-Bibliotheken, in denen alle experimentell abzuprüfenden Genotypen durch mehrere sgRNAs vertreten sind [3]. Bislang wurden sgRNA-Bibliotheken mittels klassischer DNA-Klonierung hergestellt, mit dem gravierenden Nachteil, dass in diesen Reagenzien die Diversität mit der Verteilung gekoppelt ist. Je grösser eine Sequenzbibliothek wird, desto ungleichmäßiger sind die einzelnen Sequenzen verteilt, sodass die Qualität der Bibliothek und damit auch die experimentellen Möglichkeiten leiden. Letztendlich können daher mit konventionellen sgRNA-Bibliotheken immer nur begrenzte Bereiche des Genoms simultan analysiert werden.
 
Covalently-closed-circular synthesized (3Cs) CRISPR / Cas gRNAs
Die Entwicklung einer neuen Technologie zur Produktion von sgRNA-Bibliotheken deckt nun den Bedarf an immer größer werdenden Reagenzien mit ausgewogener Sequenzverteilung.

Diese sogenannte 3Cs-Methode (covalently-closed-circular synthesized) macht sich die Kunkel-Mutagenese zunutze: Ein zirkuläres, einzelsträngiges DNA-Molekül, erzeugt aus lentiviralen Plasmiden, wird mit einem komplementären DNA-Oligonukleotid hybridisiert, welches dann entlang des Einzelstrangs verlängert wird, sodass ein doppelsträngiges DNA-Molekül entsteht [4,5]. Die Diversität einer 3Cs-sgRNA-Bibliothek wird definiert durch die Zahl der zur Hybridisierung angebotenen DNA-Oligonukleotide. Da die 3Cs-Methode ohne PCR und Klonierung auskommt, lassen sich so qualitativ hochwertige CRISPR/Cas sgRNA-Bibliotheken in quasi unlimitierter Diversität erzeugen [6].

 
3Cs entkoppelt Diversität und Verteilung
Als proof-of-principle wurden sechs sgRNA-Bibliotheken mit ansteigender Sequenzdiversität erzeugt. Dazu wurde für die 3Cs-Reaktion ein zufällig generierter Pool sgRNA-kodierender DNA-Oligonukleotide eingesetzt. Die Oligonukleotide enthielten randomisierte Nukleotide (N), sodass nach der 3Cs-Reaktion (Abb. 1) in den sechs Bibliotheken jeweils zwischen 256 (44) und 262.144 (49) spezifische sgRNAs vertreten waren (Abb. 2A). Diese 3Cs-Bibliotheken wurden mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) auf Qualität und Vollständigkeit überprüft, und die relative Häufigkeit jeder einzelnen sgRNA-Sequenz innerhalb einer Bibliothek wurde berechnet (Abb. 2B). Eine perfekte, gleichmäßige Verteilung aller sgRNAs entspräche einer Linie von 0 bis 1, mit einer Fläche unter der Kurve (engl. area under the curve, AUC) von 0,5. Alle sechs getesteten 3Cs-sgRNA-Bibliotheken waren nicht nur vollständig, sondern zeigten unabhängig von der jeweiligen Diversität sehr ähnliche AUC-Werte (Abb. 2B). Somit konnten Diversität und Verteilung durch die 3Cs-Technologie entkoppelt werden – die einzelnen sgRNA-Spezies waren in den größten Bibliotheken ebenso ausgewogen verteilt wie in den kleineren.
 
3Cs-Bibliotheken für die biomedizinische Grundlagenforschung
Um die Funktionalität von 3Cs-Bibliotheken in einem zellulären Screening-Experiment sicher zu stellen, wurde eine 3Cs-Bibliothek gegen alle menschlichen Deubiquitinasen (DUBs) erzeugt und in einem negativen Screen angewendet, bei dem als biologischer Endpunkt das Zellüberleben gemessen wurde. Auch in der 3Cs-DUB-Bibliothek waren alle sgRNAs vorhanden und mit einem AUC-Wert von 0,6 gleichmäßig verteilt (Abb. 2B), sodass die Entkopplung von Diversität und Verteilung ein qualitatives Merkmal der 3Cs-Technologie ist. Die DUB-Bibliothek wurde dann genutzt, um die Essentialität individueller DUBs für das Überleben von humanen hTERT-RPE1-Zellen zu beurteilen. Experimentelle Kontrollen dokumentierten eine sehr gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und identifizierten neue und bekannte Deubiquitinasen als Regulatoren des Zellwachstums. Dieses experimentelle Design ist ein typisches Beispiel für einen drop-out screen, bei dem die für das Zellüberleben essentiellen sgRNAs im Verlauf des Experiments abgereichert werden.
Der Anwendung der 3Cs-Technologie scheinen in Bezug auf die Größe der Bibliotheken keine Grenzen gesetzt. So wurde eine genomweite, in kodierenden wie nicht-kodierenden Bereichen angreifende 3Cs-Bibliothek, die TGW-Bibliothek (engl. truly genome-wide), die eine Sequenzdiversität von 7.3 x 1010 aufwies, erzeugt. Auch bei dieser Bibliothek war die Verteilung der sgRNAs exzellent, und in zellulären Screening-Experimenten konnten Tausende sgRNAs identifiziert werden, die eine Doxorubicin-Resistenz vermitteln. Positive Screening-Experimente, bei denen wie in diesem Fall sgRNAs angereichert werden, kommen insbesondere in Studien zur synthetischen Lethalität in der Krebsforschung zum Einsatz und geben erste Hinweis auf potenziell lohnende neue drug targets. In Validierungsexperimenten können diese dann mit einer kleineren, individuell angepassten sgRNA-Bibliothek bestätigt werden.
Die 3Cs-Technologie wurde von der Goethe-Universität zum Patent angemeldet und das Start-up Unternehmen Vivlion wurde gegründet, um die 3Cs-CRISPR/Cas-Screeningreagenzien für eine breite Anwendung in Forschung und Entwicklung verfügbar zu machen. Limitiert wird die Anwendung der 3Cs-Bibliotheken lediglich durch den benötigten Aufwand an Zellkultur. Nutzer sollten daher das experimentelle Design sorgfältig planen, um am Ende auch eine robuste Aussage zu erhalten.
 
Fazit und Ausblick
Mit der 3Cs-Technologie wurde eine Methodik entwickelt, die die Produktion von sgRNA-Bibliotheken in bislang ungekannter Diversität ermöglicht. Die stabile Qualität der 3Cs-Reagenzien erlaubt Experimente in neuen Dimensionen, so z.B. die Interrogation von kodierenden wie nicht-kodierenden Bereichen. Durch das schnelle und flexible Design neuer Bibliotheken werden iterative Zyklen wesentlich erleichtert, so können erhaltene Ergebnisse aus großangelegten Screens zügig mit kleineren, individualisierten Bibliotheken validiert werden. Damit sind 3Cs-Reagenzien immer dann eine robuste Alternative, wenn hohe Ansprüche an Qualität und Diversität gegeben sind.
 
 
Autoren
Kerstin Koch1,2 und Manuel Kaulich1,
 
 
Zugehörigkeiten
1Institut für Biochemie II, Goethe-Universität Frankfurt – Medizinische Fakultät, Universitätskrankenhaus, Frankfurt am Main, Deutschland
2Vivlion GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland

 

Kontakt   
Dr. Manuel Kaulich

Gruppenleiter am Institut für Biochemie II
Goethe-Universität Frankfurt
CEO der Vivlion GmbH
Frankfurt, Deutschland
kaulich@em.uni-frankfurt.de
kaulich@vivlion.de
http://bit.ly/biochem2-geg
www.vivlion.de

 

Referenzen

[1]  Miles LA, Garippa RJ, Poirier JT. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. FEBS J [Internet]. 2016 Sep 1 [cited 2019 Jul 29];283(17):3170–80. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/febs.13770
[2]  Sanjana NE. Genome-scale CRISPR pooled screens. Anal Biochem [Internet]. 2017 Sep 1 [cited 2019 Jul 29];532:95–9. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269716300896?via%...
[3]  Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science (80- ) [Internet]. 2013/12/18. 2014 Jan 3 [cited 2018 Jul 24];343(6166):80–4. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24336569 http://www.sciencemag.org/content/343/6166/80.full.pdf
[4]  Kunkel TA. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 1985 [cited 2018 Feb 26];82(2):488–92. Available from: http://www.pnas.org/content/pnas/82/2/488.full.pdf
[5]  Kunkel TA. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr Protoc Neurosci [Internet]. 2001 May [cited 2018 Feb 23];Chapter 8:Unit 4 10. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/0471142727.mb0801s13
[6]  Wegner M, Diehl V, Bittl V, de Bruyn R, Wiechmann S, Matthess Y, et al. Circular synthesized CRISPR/Cas gRNAs for functional interrogations in the coding and noncoding genome. Elife [Internet]. 2019/03/07. 2019 Mar 6 [cited 2019 Mar 7];8. Available from: https://elifesciences.org/articles/42549

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