3D Zellkultursubstrate

Einfluss der Dreidimensionalität von Substraten auf die Zellkultur

  • Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie EZM-Molekülen und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie EZM-Molekülen und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).
  • Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie EZM-Molekülen und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).
  • Abb. 2: (a) 3D Rekonstruktion einer Zelle (grün) in einem Polyethylenglycol-Hydrogel (PEG). (b,c) 3D Rekonstruktion und konfokale Darstellung einer Zelle in Netzwerk aus Polyacetide (PDLLA). (d) Eine Herzzelle ist zwischen zwei flexbilen Säulen aus Polydimethylsiloxane (PDMS) positioniert (grün = Lebendfärbung mit Calcein, rot = DiD Färbung der Säulen; Größenbalken: 10 μm). (Modifiziert nach [7,15,26])
  • Abb. 3: Direct Laser Writing (DLW) erlaubt die Herstellung von unterschiedlichen, geometrisch genau definierten 3D Strukturen wie z.B. (a) Gitterstrukturen, (b) Dreiecken, und (c) Stufensystemen. In diesen 3D Strukturen können Zellen kultiviert werden (d-f) (blau = Nukleus, grün = F-Aktin, rot bzw. violett = Fibronektin). (Modifiziert nach [20,25], Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduced with permission.)

Unser heutiges Wissen über zellbiologische Prozesse basiert meist auf traditionellen Standardzellkulturtechniken mit planaren, zweidimensionalen (2D) Plastik- oder Glassubstraten. Betrachtet man Zellen allerdings in ihrer natürlichen Umgebung, so wachsen diese meist in einem dreidimensionalen (3D) Verbund wie z.B. in Geweben. Harte 2D Zellkultursubstrate (Steifigkeit von ca. 2 GPa) spiegeln somit nur unzureichend die natürlichen Wachstumsbedingungen von tierischen Zellen im Organismus wieder (Steifigkeit von Geweben ca. 1 - 100 kPa). Dementsprechend sollten unsere bisherigen Erkenntnisse über zellbiologische Prozesse, die unter wenig physiologischen 2D Kulturbedingungen gewonnen wurden, zukünftig durch Studien unter physiologisch realeren 3D Kulturbedingungen komplementiert bzw. richtig gestellt werden. Bisherige Vergleichsexperimente haben gezeigt, dass Zellen sich in ihrer Morphologie und in ihrem Verhalten stark unterscheiden, je nachdem ob sie auf einer 2D Oberfläche oder in einer 3D Umgebung kultiviert werden.

Zellkultur in der zweiten Dimension
Im Allgemeinen ist das Untersuchen von Zellverhalten auf 2D Substraten und in Gegenwart von biochemischen bzw. physikalischen Faktoren mittlerweile eine gut etablierte und erfolgreiche Methode in der zellbiologischen Forschung. Aufgrund der aktuellen Limitation der experimentellen Modelle ist es allerdings - global betrachtet - noch nicht abzusehen, wie die zahlreich existierenden, chemischen sowie physikalischen Stimuli gleichzeitig eine spezifische Zellantwort auslösen (Abb. 1). Während der letzten Dekade wurde umso deutlicher, dass neben biochemischen Faktoren wie z.B. Adhäsionsmolekülen auch die physikalischen Eigenschaften der Extrazellulären Matrix (EZM) einen entscheidenden Einfluss auf das Zellverhalten, wie beispielsweiseauf die Zelldifferenzierung, nehmen [1-6]. Die physikalischen Eigenschaften der zellulären Umgebung beinhalten hierbei unter anderem die mechanische Steifigkeit, die Topographie und die räumliche Anordnung bestimmter Liganden (Abb.

1). Die räumliche Anordnung der Liganden umfasst verschiedene Längenskalen und reicht von wenigen Nanometern (z.B. für die Bindung an Zellmembrankomponenten) bishin zu einigen Mikrometern (z.B. für die Bildung von einzelnen Adhäsionskontakten auf zellulärer Ebene). Studien mit 2D nano- und mikrostrukturierten Oberflächen haben gezeigt, dass die räumliche Verteilung der Liganden einen deutlichen Einfluss auf verschiedene, physiologische Prozesse wie z.B. auf die Zellvitalität und Zellproliferation, hat. Zusätzlich zur geometrischen Anordnung der Liganden, spielt auch die Steifigkeit des 2D Zellsubstrates eine wichtige Rolle bei der Regulation von allgemeinem Zellverhalten. Es wurde gezeigt, dass sich die Organisation von Zellen stark verändert, sobald diese auf weichen 2D Substraten kultiviert werden [3].

Zellkultur in der dritten Dimension
Vergleicht man Zellen, die auf einer 2D Oberfläche kultiviert werden, mit Zellen in einer physiologischen 3D Umgebung, so variieren diese deutlich in ihrer Morphologie, in der Ausbildung ihrer Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, sowie im Grad ihrer Differenzierung [7]. Das erste Experiment zur Kultivierung von Zellen in einer 3D Umgebung fand Anfang des 20. Jahrhunderts statt: Hierbei kultivierte Ross Harrison embryonale Froschzellen auf verschiedenen Substraten und fand heraus, dass Zellen eine polygone Form annehmen, wenn sie auf flachen 2D Substraten wachsen, jedoch elongiert und spindelförmig erscheinen, wenn sie in einem 3D Spinnennetz angesiedelt werden [8]. Seit damals wurden umfassende Studien durchgeführt, um den Einfluss der 3D Umgebung auf das Verhalten verschiedenster Zelltypen zu untersuchen. Neben natürlichen tier- oder zellkultursezernierten EZM-Gelen wurden hierbei Gele aus natürlichen (z.B. Kollagen) oder synthetischen (z.B. PMMA) Polymeren eingesetzt. Es zeigte sich, dass die Kultivierung von Zellen auf 2D vs. 3D Substraten einen entscheidenden Einfluss auf das Zellverhalten nimmt. Zellen, die in einer zellkultursezernierten 3D EZM Umgebung kultiviert werden, weisen eine elongierte, spindelförmige Morphologie und eine abweichende Zusammensetzung ihrer Adhäsionskontakte auf [9]. Auch das Migrationsverhalten [10], die Proliferation [9] und die Fibrillogenese [11] unterscheiden sich im Vergleich zu Zellen in einer 2D Kulturumgebung. Betrachtet man z.B. Zellen, die in 3D gewebe abstammenden Matrices wachsen, so divergiert die molekulare Zusammensetzung ihrer Zell-Matrix-Adhäsionen mit der von Zellen, die unter 2D Bedingungen gehalten werden [9]. Wie schon erwähnt, beeinflusst nicht nur die chemische Zusammensetzung der Oberfläche, sondern auch die Topographie entscheidend das Zellverhalten. Von daher nutzten Shoichet et al. poröse Mikrofibrillen um das Wachstum von dorsalen Wurzelganglien zu fördern [12]. Es zeigte sich, dass Axone des zentralen Nervensystems in einer Umgebung regenerieren können, die der des natürlichen peripheren Nervensystems möglichst nahe kommt. Die künstlichen Mikrofasern, die sie dabei nutzten, stellen einen kritischen Punkt für die Wachstumsrichtung wie auch für die Wachstumslänge der Axone dar. Neben der Topographie ist auch die Kontrolle der mechanischen Eigenschaften einer 3D Umgebung von Bedeutung. Hierbei stehen insbesondere poröse Materialien im Fokus [13], da diese zukünftig die Herstellung künstlicher, biomimetischer Gewebe erlauben (Abb. 2). Tatsächlich kann der Ersatz von Körpergeweben- und -teilen durch poröse, meist weiche Materialien helfen, natürliches, menschliches Gewebe nachzubilden. Die beste Option bildet hierbei ein Polymer, wie z.B. PMMA [14], das im Körper langsam abgebaut wird und anschließend ein natürliches Transplantat hinterlässt.

Bisherige Studien in 3D Substraten wurden an einer Vielzahl verschiedenster Zelltypen - inklusive Primärzellen und Zelllinien - getestet. Neben Vitalitätstests wurden hierbei auch Tests zur Zytotoxizität der verwendeten Materialien durchgeführt. Insgesamt zeigte sich, dass die meisten verwendeten (synthetischen) Polymere eine geringe Zytotoxizität aufweisen und eine Proliferation der Zellen begünstigen. Außerdem wurde der Einfluss der 3D Zellsubstrate auf die Differenzierung von (mesenchymalen) Stammzellen in Fett-, Knochen-, und Knorpelzellen untersucht [15-19]. In Zukunft könnten spezifische 3D Zellkultursubstrate hilfreich sein, um Stammzellnischen erfolgreich nachzubilden und somit die Differenzierung gezielt zu kontrollieren. Hierzu muss der Fokus verstärkt auf Einzelzellstudien gelegt werden, um zellspezifische Verhaltensweisen wie z.B. die Morphologie, Form, Adhäsion und Migration von Zellen besser im Detail untersuchen zu können. In bisherigen 3D Studien wurde meist mit einer hohen Anzahl an Einzelzellen oder Zellagglomeraten gearbeitet, die oft nur eine „Ja-Nein"-Antwort, z.B. in Bezug auf die Zelladhäsion oder Zellvitalität, erlauben. Spezifische Einzelzellantworten waren damit aber bis dato nicht möglich [20].

Neuartige 3D Substrate
Obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl an 3D Studien unser Verständnis hinsichtlich zellbiologischer Prozesse erweitert haben, gilt es noch immer einige Probleme zu lösen. Bisher waren 3D Umgebungen schwierig zu kontrollieren und bezüglich ihrer Geometrie oft unzureichend definiert (z.B. zufällige Porengröße). Auch ihre chemische Zusammensetzung und ihre mechanischen Eigenschaften ließen sich nur schwer kontrollieren. Betrachtet man z.B. zellkultursezernierte 3D Umgebungen, so weisen diese zwar eine starke Ähnlichkeit zur in vivo Situation auf, sind jedoch in ihrer Komplexität so unkalkulierbar, dass die Analyse bestimmter Parameter wie der biochemischen Zusammensetzung und Steifigkeit kaum möglich ist. Andere etablierte, künstliche 3D Systeme wie Mikrocarrier [21], synthetische Hydrogele [22] oder mikrostrukturierte, adhäsive Oberflächen [23] erlauben zwar eine Nachbildung der porösen EZM und sind in ihrer geometrischen Form kontrollierbar, lassen sich allerdings nicht völlig flexibel gestalten. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Entwicklung von neuartigen 3D Zellkultursubstraten mit diversen, chemischen Funktionalisierungsmethoden weiter voranzutreiben. Zukünftig ließen sich damit einige zellbiologisch relevante Fragestellungen aufklären, wie z.B. welchen Einfluss eine bestimmte Verteilung an biochemischen Liganden auf das Zellverhalten nimmt oder welche Rolle die mechanische Steifigkeit der 3D Umgebung spielt.

Um die Lücke zwischen einer komplexen, natürlichen in vivo Situation und einer stark vereinfachten in vitro Situationen zu schließen, haben wir 3D Mikrostrukturen entwickelt, die eine systematische Untersuchung von klar definierten Parametern wie Dreidimensionalität, Substratsteifigkeit und biochemische Zusammensetzung auf das Zellverhalten ermöglichen. Die Herstellung dieser definierten 3D Mikrostrukturen erfolgt mit Hilfe der Zwei-Photonen-Polymerisation durch Direct Laser Writing (DLW). In unserem Labor werden unter anderem fibronektin-funktionalisierte 3D Zellkultursubstrate mit variierender Geometrie gefertigt, um Zell-Matrix-Adhäsionen zu untersuchen [24,25] (Abb. 3). Bei der Untersuchung der Form und des Volumens von Zellen mit unterschiedlichem Gewebeursprung konnten zelltypspezifische Änderungen des Zellvolumens festgestellt werden. Während mesenchymal abstammendeZellen in 3D ein größeres Volumen als in 2D aufweisen, zeigene phithelial-abstammende Zellen keinen Unterschied bezüglich ihres Volumens zwischen 3D und 2D. Dieses differente Verhalten zwischen mesenchymal- und epithelial-abstammenden Zellen lässt sich vermutlich anhand ihrer unterschiedlichen Gewebeherkunft erklären. Während mesenchymale Zellen in vivo meist eingebettet in der EZM vorliegen, bilden epitheliale Zellen flache Oberflächen. In natürlichen Geweben wirken außerdem immer mechanische Kräfte wie Kompression, Dehnung und Scherkräfte auf die Zellen. Umgekehrt generieren aber auch Zellen selbst starke Kontraktionskräfte und modellieren somit ihre 3D Umgebung. Es ist wichtig die Wechselwirkung von Zellen und Kräften in 3D aufzukären, um solch elementare Prozesse wie z.B. die Gewebedifferenzierung verstehen zu können .Auch in pathologischer Hinsicht könnte man hierdurch Fortschritte erzielen und neue Therapieansätze erstellen, da mechanische Aspekte mit unterschiedlichen Krankheiten wie z.B. Asthma oder Krebs assoziiert werden.

Ausblick
Während der letzten Jahre konnten durch eine verstärkt interdisziplinärwirkende Forschung signifikante Fortschritte in der Herstellung neuer 3D Zellkultursubstraten erzielt werden. Nichtsdestotrotz sind die Herstellungstechniken und -materialien, die für eine wirklichkeitsgetreue Nachbildung von 3D Substraten geeignet wären, noch weitestgehend limitiert. Die Kombination verschiedenster Materialien und deren präzise, geometrische Kontrolle stellen ein großes Potential bei der Entwicklung von 3D Zellkultursubstraten dar. Sie können uns zukünftig helfen, ein tieferes Verständnis über zellbiologische Prozesse zu erlangen, ohne dabei die Wirkung physikalischer und biochemischer Signale außer Acht zu lassen. Insbesondere die Identifizierung von Signaltransduktionswegen, die bei der zellulären Wahrnehmung einer dreidimensionalen Umgebung entscheidend sind, steht dabei im Fokus. Ein zentraler Ansatzpunkt für die Zukunft wird die Weiterentwicklung von Techniken sein, um systematisch die mechanischen Eigenschaften eines 3D Zellkultursubstrates kontrollieren zu können. Des Weiteren wird die spezifische Funktionalisierung mit zwei oder mehr Biomolekülen von Interesse sein, um damit die physiologische 3D Umgebung einer Zelle nachzuahmen. Berücksichtigt man gleichzeitig die geometrischen, chemischen und mechanischen Eigenschaften eines 3D Zellkultursubstrates, so werden wir ein genaueres Abbild der in vivo Situation erhalten. Dies wird uns einerseits ein detaillierteres Verständnis über physiologische Prozesse liefern, andererseits aber auch neue Möglichkeiten bei der Erstellung von Therapieansätzen und in der regenerativen Medizin bieten.

Referenzen:
[1] Frantz C. et al.: J Cell Sci 123: 4195-4200 (2010)
[2] Dufort CC et al.: Nat Rev Mol Cell Biol 12:308-319 (2011)
[3] Engler AJ. et al.: Matrix elasticity directsstem cell lineage specification. Cell 126: 677-689 (2006)
[4] Bettinger CJ. et al.: Angew Chem Int Ed Engl 48: 5406-5415 (2009)
[5] Falconnet D. et al.: Biomaterials 27: 3044-3063 (2006)
[6] Ross AM et al.: Small 8: 336-355 (2012)
[7] Baker BM und Chen CS.: J Cell Sci 125: 3015-3024 (2012)
[8] Harrison RG.: Journal of Experimental Zoology 17: 521-544 (1914)
[9] Cukierman E. et al.: Science 294: 1708-1712 (2001)
[10] Pankov R. et al.: J Cell Biol 170: 793-802 (2005)
[11] Mao Y. et al.: J Cell Sci 118: 4427-4436 (2005)
[12] Shaw D. et al.: J Craniofac Surg 14: 308-316 (2003)
[13] Dehghani F. et al.: Curr Opin Biotechnol. (2011)
[14] Kantlehner M. et al.: Chembiochem 1: 107-114 (2000)
[15] Kumar G. et al.: Biomaterials 32: 9188-9196 (2011)
[16] Chang C.C. et al.: J Biomed Mater Res B Appl Biomater 98: 160-170 (2011)
[17] Lee S.A. et al.: Lab Chip 9: 1670-1675 (2009)
[18] Pauloehrl T. et al.: Angew Chem Int Ed Engl 51: 1071-1074 (2012)
[19] Wozniak M.A., Chen C.S.: Nat Rev Mol Cell Biol 10: 34-43 (2009)
[20] Greiner AM. et al.: Macromol Biosci 12: 1301-1314 (2012)
[21] Yang Y. et al.: Biomaterials 28: 3110-3120 (2007)
[22] Mann B.K. et al.: Biomaterials 22: 3045-3051 (2001)
[23] Ochsner M. et al.: Lab Chip 7: 1074-1077 (2007)
[24] Klein F. et al.: Advanced Materials 22: 868-871 (2010)
[25] Klein F. et al.: Advanced Materials 23: 1341-1345 (2011)
[26] Legant W.R. et al.: Integr Biol (Camb) 4: 1164-1174 (2012)

Autor(en)

Kontaktieren

Karlsruher Institut für Technologie KIT
Haid-und-Neu-Str. 9
76131 Karlsruhe
Telefon: 0721/608-8586
Telefax: 0721/608-9069

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.