Adulte Stammzellen für autologe Zelltherapie

Die Nase als neue Quelle multipotenter Stammzellen

  • Von links nach rechts: Dr. Darius Widera, M.Sc. Stefan Hauser, Prof. Dr. Christian Kaltschmidt, Prof. Dr. Barbara Kaltschmidt, Universität BielefeldVon links nach rechts: Dr. Darius Widera, M.Sc. Stefan Hauser, Prof. Dr. Christian Kaltschmidt, Prof. Dr. Barbara Kaltschmidt, Universität Bielefeld
  • Von links nach rechts: Dr. Darius Widera, M.Sc. Stefan Hauser, Prof. Dr. Christian Kaltschmidt, Prof. Dr. Barbara Kaltschmidt, Universität Bielefeld
  • Abb. 1: Endogene Nische der ITSCs in der unteren Nasenmuschel. (A) Fotografische Abbildung einer isolierten Nasenmuschel (links) und eine schematische Darstellung. (B) HE-Färbung einen Gewebeschnittes. Im oberen Drittel ist die charakteristische Erscheinungsform des Riechepithels mit zahlreichen Flimmerhärchen erkennbar. Unterhalb der epithelialen Schicht befindet sich die Lamina Propria. (C) Immunohistochemische Färbung eines Gewebeschnittes gegen den NCSC-spezifischen Marker Nestin. Deutlich erkennbar sind die in der Lamina Propria lokalisierten, Nestin-positiven Stammzellen.
  • Abb. 2: Kultivierung der ITSCs in Blutplasma. (A) Immunocytochemische Färbung von ITSC Neurosphären gegen den NCSC-spezifischen Marker Nestin. (B) Helium- Ionen-mikroskopische Aufnahme der dreidimensionalen Fibrin-Matrix mit unterschiedlich großen Poren. (C) 3-dimensionales Wachstum der GFP-transfizierten ITSCs in der Fibrin-Matrix (tiefenkodierte Darstellung) (D) 3D-Rekonstruktion der Distribution von GFP-transfizierten ITSCs in der Matrix.
  • Abb. 4: Schematische Darstellung einer möglichen klinischen Applikation von ITSCs in 3-dimensionaler Fibrin-Matrix. Humane, autologe Neuralleistenstammzellen aus der unteren Nasenmuschel und humanes Blutplasma können dem Patienten entnommen werden. Nach einer Expansion der ITSCs in der 3D-Matrix können diese, ohne vorherige Entfernung der Zellen aus der Matrix transplantiert werden.
  • Abb. 3: Differenzierungspotential der kultivierten ITSCs. (A) Immunocytochemische Färbung von neuronal differenzierten ITSCs. Ein neuronales Netzwerk kann durch die spezifische Expression von β-III-Tubulin und Neurofilament nachgewiesen werden. (B) ALP Aktivität der osteogen differenzierten Zellen. (C) Immunohistochemische Färbung mit Alcianblau als Nachweis für eine erfolgreiche Differenzierung in chondrogene Zellen (D) Nachweis der adipogenen Differenzierung durch Oil Red O gefärbte Lipidtröpfchen in Zellen.

Adulte Neuralleistenstammzellen (neural crest-derived stem cells, NCSCs) sind aufgrund ihrer meist minimal-invasiven Isolierung und des hohen Differenzierungspotentials von besonderem Interesse für die Entwicklung zellbasierter Therapieansätze. Kürzlich gelang es uns, eine neue NCSC-Population aus der Nase zu isolieren und unter Verwendung von personalisierbaren Kultivierungsbedingungen effizient zu vermehren. Diese Stammzellen können als Basis für eine autologe, zellbasierte Therapie zur Behandlung komplexer Krankheitsbilder dienen.

Humane adulte Neuralleistenstammzellen

Während der embryonalen Entwicklung migrieren so genannte Neuralleistenzellen in verschiedene Bereiche des Körpers, wo sie Zelltypen wie Neurone, Gliazellen und Melanozyten hervorbringen [1, 2]. Solche hochgradig plastischen Zellen lassen sich auch in verschiedenen Geweben des adulten Organismus vorfinden und werden konsequenterweise als Neuralleistenstammzellen bezeichneten. In vitro verhalten sich NCSCs wie multipotente, sich selbsterneuernde Stammzellen, welche in der Lage sind, in zahlreiche Zelltypen zu differenzieren.

Diese Eigenschaften machen adulte Stammzellen zu vielversprechenden Kandidaten für patientenspezifische, autologe Therapien. Besonders im Kopfbereich, welcher in der Entwicklung ausschließlich von Neuralleistenzellen gebildet wird, konnten in den vergangenen Jahren verschiedene Quellen von NCSCs entdeckt werden (zur Übersicht siehe [3]). So konnten NCSCs z. B. im Gaumen, im periodontalen Ligament oder in Haarfollikeln gefunden werden [4–6].

Die von unserer Gruppe kürzlich neu entdeckte Quelle humaner Neuralleistenstammzellen befindet sich im Bereich der unteren Nasenmuschel [7]. Diese Stammzellen konnten minimal-invasiv isoliert und in vitro effizient vermehrt werden. Hierbei wurde eine spezielle Kultivierungsmethode entwickelt, bei der humanes Blutplasma als Additiv verwendet wird [8]. Dadurch ist man in der Lage, in kurzer Zeit eine große Anzahl von Stammzellen zu generieren, was für einen potenziellen klinischen Einsatz unumgänglich ist. Weiterhin gelang es, diese Stammzellen effizient in diverse ektodermale und mesodermale Zelltypen zu differenzieren.

Isolierung und Kultivierung von ITSCs

Die untere Nasenmuschel, welche in etwa die Größe des Kleinfingers besitzt, ist leicht horizontal an der seitlichen Nasenwand angeordnet (Abbildung 1(A)).

Aufgrund dieser anatomischen Lage kann durch einen minimal-invasiven Eingriff eine große Menge an Ausgangsmaterial gewonnen werden. Dieser Eingriff wird u. A. bei Patienten durchgeführt, die unter Schnarchen leiden. Jüngere Studien suggerierten, dass die Nasenmuschel ein hohes regeneratives Potential aufweist, da transplantiertes Gewebe aus diesem Bereich dazu in der Lage war, mittlere bis große Perforationen des nasalen Septums zu schließen.

Daher schien das Vorhandensein von mindestens einer Stammzellpopulation mehr als wahrscheinlich. Anatomisch gesehen, besteht die humane untere Nasenmuschel aus zwei Schichten: dem so genannten respiratorischen Epithelium und der darunter liegenden Lamina Propria (Abb. 1(B)). Durch immunohistochemische Analysen konnten wir zunächst zeigen, dass die Lamina Propria Nestin-positive Stammzellen beinhaltet, welche eng an Nervenfasern angrenzen (Abb. 1 (C)). Aufgrund ihrer Lage nannten wir die neu entdeckten Stammzellen „inferior turbinate stem cells“ (ITSCs).

Zur Isolierung von ITSCs, wurden Nasenmuscheln mechanisch zerkleinert und anschließend enzymatisch verdaut. Die nun vorliegende Zellsuspension wird in ein spezielles Kulturmedium überführt und bei 37 °C bei 5 % O2 und CO2 inkubiert. In diesem Medium bilden die Stammzellen sogenannte Neurosphären, welche den stammzell-spezifischen Marker Nestin exprimieren (Abb. 2 (A)). Alle anderen Zelltypen, wie z.B. Bindegewebezellen sind nicht in der Lage, sich in diesem Medium zu vermehren, was zu einer initialen Selektion der Stammzellen führt. Im Anschluss an diese Selektionssphase wird humanes Blutplasma als Kulturmediumadditiv hinzugefügt.

Durch die Coagulation von Blutplasma-Fibrinogen zu Fibrin-Polymeren entsteht eine dichte Fibrin-Matrix (Abb. 2(B)), welche jedoch zahlreiche Poren aufweist und somit ein dreidimensionales Wachstum der Zellen ermöglicht. Dies konnte mittels konfokaler Lasermikroskopie und anschließender 3D-Rekonstruktion von GFP-transfizierten ITSCs nachgewiesen werden (Abb. 2 (C) und (D)). Die Kultivierung in dieser 3D-Matrix resultierte in einem deutlich erhöhten Proliferationspotential mit Verdopplungszeiten von unter 30 Stunden ohne Veränderung der typischen Stammzelleigenschaften, wie etwa des Expressionsprofils oder der Differenzierung.

Eine solche rapide Vermehrung von Stammzellen ist für eine klinische Anwendung essentiell, da die Kultivierungszeit laut der US-amerikanischen Zulassungsbehörde Food and Drug Administration (FDA) 5 Wochen nicht überschreiten sollte [9]. Vergleichbare Verdopplungszeiten von Stammzellen können aktuell nur mit dem Zusatz von fötalem Kälberserum (FCS) erreicht werden, dessen Verwendung jedoch für zellbasierte Therapieansätze umstritten ist, da dies unter anderem zu Immunantwort des Empfängers führen kann [10].

Differenzierungspotential der kultivierten ITSCs

Eine essentielle Eigenschaft der Stammzellen ist die Möglichkeit der Differenzierung in verschiedene spezialisierte Zelltypen. Um das Differenzierungspotential von Stammzellen in vitro zu überprüfen, werden diese unter Verwendung von spezifischen Differenzierungsmedien kultiviert. Mittels geeigneter Induktionsprotokolle gelang es, adulte ITSCs gezielt in die neuronale, osteogene (Knochenzellen), chondrogene (knorpelbildende Zellen) und adipogene (Fettzellen) Richtung zu differenzieren (Abb. 3). Dabei konnte die neuronale Differenzierung durch immunocytochemische Nachweise der Markerproteine β-III-Tubulin und Neurofilament bewiesen werden (Abb. 3(A)).

Des Weiteren konnte durch Recycling von synaptischen Vesikeln ein funktioneller Differenzierungsnachweis erbracht werden. Die Bildung von Knochenzellen (osteogene Differenzierung) konnte neben einem Nachweis der Aktivität des Enzyms Alkalische Phosphatase (Abb. 3 (B)) durch die Visualisierung von Calciumeinlagerungen mittels von Kossa- und Alizarinrot-Färbungen gezeigt werden. Weiterhin gelang der Nachweis einer erfolgreichen chondrogenen Differenzierung, welche durch den Nachweis von Proteoglykane in der extrazellulären Matrix über die Alcianblau Färbung gezeigt werden konnte (Abb. 3 (C)). Zusätzlich sind ITSCs dazu in der Lage, Adipozyten hervorzubringen, was durch eine Färbung der Lipidtröpfchen mittels Oil Red O visualisiert werden konnte (Abb. 3 (D)).

All dies verdeutlicht, dass ITSCs ein besonders hohes Differenzierungspotential besitzen und in vitro gezielt in ektodermale und mesodermale Zelltypen differenziert werden können. Basierend auf den von uns gewonnen Daten lässt sich ein potentielles therapeutisches Behandlungsschema unter gleichzeitiger Verwendung von ITSCs und autologem Blutplasma aufstellen. Hierbei könnten zukünftig während eines kombinierten Eingriffs gleichzeitig humane, autologe Neuralleistenstammzellen aus der unteren Nasenmuschel und humanes Blutplasma dem Patienten entnommen werden (Abb. 4).

Nach einer darauffolgenden, schnellen Expansion der Stammzellen in der autologen 3DMatrix können diese in der Matrix transplantiert werden. So könnten die Patienten von der verkürzten Kultivierungsdauer, und von der Verringerung der Gefahr einer Abstoßungsreaktion nach der Transplantation profitieren. Aufgrund des hohen Differenzierungspotentials der ITSCs, ist deren Verwendung zur Regeneration von komplexeren Verletzungen im Kopfbereich denkbar, da sowohl ektodermale als auch mesodermale (Knochen, Knorpel, Fett) Zelltypen entstehen können. Literatur ist bei den Autoren erhältlich

Kontakt

M.Sc. Stefan Hauser

Doktorand, Molekulare Neurobiologie

stefan.hauser@uni-bielefeld.de

Dr. Darius Widera

Wissenschaftlicher Mitarbeiter,

Zellbiologie Universität Bielefeld Fakultät für Biologie

darius.widera@uni-bielefeld.de

http://web.biologie.uni-bielefeld.de/cellbiology/

Prof. Dr. Christian Kaltschmidt

Lehrstuhlinhaber Zellbiologie

c.kaltschmidt@uni-bielefeld.de

Prof. Dr. Barbara Kaltschmidt

Gruppenleiterin Molekulare Neurobiologie Universität Bielefeld Fakultät für Biologie

barbara.kaltschmidt@uni-bielefeld.de

 

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