Kardiovaskuläres Tissue Engineering

Entwicklung bioartifizieller Ersatzmaterialien

  • Abb. 1: Bioreaktorsystem: die beiden dargestellten Bioreaktoren liegen auf einer Rollvorrichtung, um während der Re-Besiedlung eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrixoberfläche zu gewährleisten. Bei den abgebildeten Schläuchen handelt es sich um Zu- und Abläufe des Nährmediums.
  • Abb. 2: Bioartifizielle Herzklappe: Die Abbildung zeigt einen bioartifiziell generierten Herzklappenkonduit nach 3monatiger Implantation im Tiermodell. Die zarten Herzklappen sind deutlich zu erkennen, Hinweise auf Vorliegen degenerativer Veränderungen zeigen sich nicht.
  • Abb.3a: Bioartifizielle Gefäßprothesen: (a) bioartifiziell generiertes Blutgefäß unmittelbar vor der Entnahme aus dem Bioreaktor (b) die histologische Analyse nach 3monatiger Implantationszeit im Tiermodell zeigt neu eingesprossene Gefäße (Vasa vasorum) als Hinweis auf die erfolgte Integration der Gefäße in den Organismus (c) elektronenmikroskopische Darstellung der inneren Oberfläche des Gefäßes mit deutlich sichtbarem endothelialem Monolayer.
  • Abb.3b: Bioartifizielle Gefäßprothesen: (a) bioartifiziell generiertes Blutgefäß unmittelbar vor der Entnahme aus dem Bioreaktor (b) die histologische Analyse nach 3monatiger Implantationszeit im Tiermodell zeigt neu eingesprossene Gefäße (Vasa vasorum) als Hinweis auf die erfolgte Integration der Gefäße in den Organismus (c) elektronenmikroskopische Darstellung der inneren Oberfläche des Gefäßes mit deutlich sichtbarem endothelialem Monolayer.
  • Abb.3c: Bioartifizielle Gefäßprothesen: (a) bioartifiziell generiertes Blutgefäß unmittelbar vor der Entnahme aus dem Bioreaktor (b) die histologische Analyse nach 3monatiger Implantationszeit im Tiermodell zeigt neu eingesprossene Gefäße (Vasa vasorum) als Hinweis auf die erfolgte Integration der Gefäße in den Organismus (c) elektronenmikroskopische Darstellung der inneren Oberfläche des Gefäßes mit deutlich sichtbarem endothelialem Monolayer.
  • PD Dr. med. Mathias H. Wilhelmi, Kompetenzzentrum für Kardiovaskuläre Implantate – Medimplant, Medizinische Hochschule Hannover

Durch die Entwicklung und Etablierung neuer Konzepte zur Rekonstruktion und Transplantation terminal geschädigter Gewebe- und Organstrukturen konnte in den vergangenen Jahren das Spektrum therapeutischer Möglichkeiten deutlich verbessert werden. Qualitative und quantitative Limitierungen, der in diesem Zusammenhang eingesetzten künstlichen und biologischen „Ersatzmaterialien" führen jedoch dazu, dass auch diese Ansätze nur als „Zwischenschritt" auf der Suche nach einer Methode „designed and constructed to meet the needs of each individual patient" [1] bezeichnet werden können.

Als wissenschaftliche Reaktion hierauf wurde daher ein Konzept entwickelt, das als „Tissue engineerings" bezeichnet wird und das Ziel verfolgt „durch gezielte Bündelung und Fokussierung von Prinzipien und Methoden von Ingenieurs- und Lebenswissenschaften über ein besseres Verständnis der Zusammenhänge von Struktur und Funktion physiologischer und pathologisch veränderter Gewebe- und Organfunktionen, die Entwicklung bioartifizieller Ersatzmaterialien voranzutreiben, die, in einen Organismus eingebracht, Gewebefunktionen wiederherzustellen, zu erhalten oder zu verbessern vermögen" [1-3]. Die vorliegende Arbeit skizziert anhand ausgewählter Beispiele die historische Entwicklung, bisherige Erfolge und zukünftige Forschungsschwerpunkte auf dem Wege zur bioartifiziellen Generierung kardiovaskulärer Implantate unter Verwendung ausschließlich biologischer Materialien.

Konzepte der regenerativen Medizin

Prinzipiell werden drei Ansätze unterschieden: [1] Guided Tissue Regeneration: Eine primär stabile, zumeist azelluläre Matrix, die bereits die Form der Zielstruktur wie z.B. die eines Blutgefäßes oder einer Herzklappe hat, wird in einen Empfänger implantiert, sodass die Matrix im Laufe der Zeit durch die spontane Besiedlung mit autologen (= patienteneigenen) Zellen zu einer voll funktionsfähigen Struktur heran reift; [2] Selective Cellular Transfer: Hierunter versteht man die lokale oder systemische Injektion von Zellpräparationen, um so selektiv die Konzentration eines spezifischen Zelltypus innerhalb des Blutkreislaufes oder eines Gewebes zu steigern.

Ein Beispiel hierfür ist die Injektion von Stammzellsuspensionen in myokardiale Infarktareale, um so regenerative Prozesse innerhalb geschädigter Gebiete zu fördern; [3] Das Tissue Engineering im eigentlichen Sinne (= klassischer Ansatz): Zuvor in vitro (= im Labor) isolierte und expandierte Zellen, die unterschiedlichen Typs und unterschiedlicher Herkunft sein können werden unter Laborbedingungen auf eine Matrix gegeben, um so bereits vor Implantation ein morphologisch und funktionell intaktes Gewebe- oder Organsubstitut zu bilden.

Unabdingbare Voraussetzung für die erfolgreiche in vitro Umsetzung eines solchen Ansatzes ist, dass ein umfangreiches organ- und gewebespezifisches Repertoire physiologischer Rahmenbedingungen, wie z.B. der Massentransfer von Sauerstoff und Nährstoffen, aber auch essentieller chemischer, physikalischer und mechanischer Stimuli geschaffen und stetig angepasst wird, um so eine möglichst physiologische Mikro- und Makrosphäre zu schaffen.
Die bioartifizielle Generierung kardiovaskulärer Strukturen:

Herzklappen:
Der erste klinische Einsatz humaner allogener Herzklappenprothesen geht auf Ross und Barret-Boyes zurück, die in den 1960-er Jahren erstmals biologische Prothesen implantierten [4, 5]. Insbesondere die im Vergleich zu mechanischen Herzklappenprothesen angenehmen Eigenschaften einer nur kurzzeitig notwendigen oralen Antikoagulation und das Fehlen störender Klappenschlussgeräusche führten dazu, dass diese biologischen Prothesen schnell an Ansehen gewannen. Als nachteilig erwies sich jedoch schon bald, dass die Klappen nach einer Zeit von 8 bis 10 Jahren zunehmend degenerative Veränderungen aufwiesen und schließlich aufgrund zunehmender Destruktion ersetzt werden mussten. Ursächlich hierfür scheinen heute insbesondere zwei Faktoren verantwortlich zu sein: [1] immunologische Reaktionen im Sinne unterschwelliger Abstoßungsreaktionen [6, 7], die offenbar im Wesentlichen auf die Antigenizität residenter allogener Zellen zurückzuführen sind und [2] die Fixierung des Gewebes mit Glutaraldehyd. Unter der Zielsetzung zumindest den Einfluss zellulärer Komponenten zu verringern, besiedelte Gulbins kryokonservierte humane Allografts ohne vorausgehende Dezellularisierung in vitro mit autologen Endothelzellen und implantierte sie erst dann in Versuchstiere. Er folgte damit der Überlegung, durch die autologe Endothelzellbeschichtung eine etwaige Immunantwort abzuschwächen und damit Kalzifizierungen und Degenerationen vorzubeugen [8]. Ein anderer Ansatz, der gewissermaßen eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens darstellte war die autologe Endothelzell-Besiedlung zuvor dezellularisieter biologischer Herzklappen. Nach guten Resultaten im Tiermodell konnten zwischenzeitlich auch erste viel versprechende Beobachtungen im Menschen beobachtet werden (human autolog re-besiedelte xenogene Herzklappen) [9]. Vor dem Hintergrund der Überlegung, dass aber auch dezellularisierte, insbesondere xenogene Matrizes, z.B. durch residuale Zuckerreste immunogene Reaktionen hervorrufen könnten, haben wir selbst in Kooperation mit der Universität Chisinau (Republik Moldavien) allogene (= humane) Herzklappen dezellularisiert, mit autologen Endothelzellen besiedelt und bei Kindern mit schweren angeborenen Herzklappenerkrankungen implantiert. Anders als die zuvor für dezellulariserte, kryokonservierte und Glutaraldehyd-behandelte Allograftklappen beschriebenen degenerativen Veränderungen zeigen unsere Klappen (allogene Matrix, ohne Glutaraldehydfixierung und autolog re-besiedelt) auch nach mehreren Jahren echokardiographisch bislang keinerlei erkennbare Kalzifizierungen oder sonstigen degenerativen Veränderungen [10, 11], sondern scheinen komplett in den kindlichen Organismus integriert, sogar mit diesem mit zu wachsen.

Blutgefäße:
Die erste rein aus biologischen Materialien generierte Gefäßprothese geht auf Weinberg und Bell zurück [12]. Sie besiedelten eine aus Kollagen Gel bestehende Matrix mit glatten Muskelzellen, umgaben sie mit einer Schicht von Bindegewebszellen und fügten dem Konstrukt schließlich Endothelzellen als innerste Schicht an. In der anschließenden Evaluation des Konstruktes beobachteten sie einen elektronenmikroskopisch nachweisbaren, geschlossenen luminalen, endothelialen Monolayer und wiesen histologisch die Präsenz von von-Willebrand-Faktor nach. Trotz dieses initial viel versprechenden Resultates waren die Prothesen ohne strukturelle Unterstützung durch ein umhüllendes Dacron-Netz jedoch so labil, das sie physiologischen Druckbelastungen zunächst nicht standhielten [12]. Erst durch Veränderung der Kulturbedingungen gelang es einer Arbeitsgruppe um L`Heureux auch ohne artifizielle externe Unterstützung eine ausreichende Stabilität zu erreichen [13, 14]. Diese Beobachtung zeigt auf eindrucksvolle Weise, welch essentielle Bedeutung den in vitro Kultivierungsbedingungen - chemisch, wie auch physikalisch - beigemessen werden muss.

In Hannover ist es uns gelungen eine native porcine Aorta enzymatisch zu dezellularisieren und anschließend mit humanen Endothelzellen und Myofibroblasten unter pulsatilen Flussbedingungen zu re-besiedeln. In der histologischen Analyse kamen die Konstrukte nativen Aorten bereits sehr nahe [15], sodass wir motiviert durch diese Ergebnisse und, ebenso wie zuvor für Herzklappen beschrieben, das Konzept der autologen zellulären Re-Besiedlung dezellularisierter Gefäßgrafts auch hier weiter verfolgt haben. Erste Tierversuche waren sehr erfolgreich, sodass wir derzeit an einer Optimierung des Verfahrens für zukünftige humane Anwendungen arbeiten.

Ausblick

Im Laufe der letzten Jahre konnten deutliche Fortschritte auf dem Gebiet der regenerativen Medizin erzielt werden. Das ursprüngliche Ziel erkrankte Gewebe durch bioartifiziell generierte Implantate ersetzen zu wollen scheint erreicht, sodass nun neben klinischen Studien, zunehmend die Entwicklung komplexerer 3D-Organstrukturen in den Fokus wissenschaftlicher Bestrebungen gerückt ist. Wissenschaftliche Hauptrichtungen zur Umsetzung dieses Ziels sind dabei insbesondere: [1] die Entwicklung und Anpassung dynamischer in vitro Systeme zur Nachahmung pyhsiologischer Mikro- und Makrospähren; [2] die Identifizierung und Etablierung von Mikro- und Nanotechnologien zur Generierung vaskularisierter Matrizes, um so die konzeptionelle Basis für höher gradig strukturierte, komplexe 3D-Gewebe und Organsysteme zu schaffen und [3] die selektive Isolation, kontaminationsfreie Expansion und Differenzierung verschiedenster, möglichst multipotenter, primär undifferenzierter Zellen zur (Re)-Vitalisierung und gerichteten Funktionalisierung von Matrizes.

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