Analyse von Holzzuckern und Uronsäuren

Eine empfindliche und selektive elektrochemische Methode für die Biokraftstoffforschung

  • Abb. 2: Chromatogramm einer Standardmischung mit 0,1 mg/mL Fucose (1), Rhamnose (2), Arabinose (3), Galactose (4), Glucose (5), Xylose (6), Mannose (7), Galacturonsäure (8) und Glucuronsäure (9); vergrößert die Peaks für die Uronsäuren.Abb. 2: Chromatogramm einer Standardmischung mit 0,1 mg/mL Fucose (1), Rhamnose (2), Arabinose (3), Galactose (4), Glucose (5), Xylose (6), Mannose (7), Galacturonsäure (8) und Glucuronsäure (9); vergrößert die Peaks für die Uronsäuren.
  • Abb. 2: Chromatogramm einer Standardmischung mit 0,1 mg/mL Fucose (1), Rhamnose (2), Arabinose (3), Galactose (4), Glucose (5), Xylose (6), Mannose (7), Galacturonsäure (8) und Glucuronsäure (9); vergrößert die Peaks für die Uronsäuren.
  • Abb. 1: Strukturformeln der sieben Holzzucker sowie der zwei Uronsäuren
  • Abb. 3: Konzentrationskurven der beschriebenen Holzzucker und Uronsäuren in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,0125 mg/ml bis 0,25 mg/ml.
  • Abb. 4: 4-stufige PAD-Potential-Wellenform zur Detektion von Monosacchariden und anderen Kohlenhydraten. Die Probenerkennung findet während tsample statt.
  • Tabelle 1: Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) für jeden Analyten berechnet aus empirischen Daten berechnet (10-μL-Injektion)
  • Tabelle 2: Methodenparameter
  • Tabelle 3: Gradientmethode
Monosaccharide gehören zu den in der Natur am häufigsten vorkommenden organischen Molekülen. Sie spielen eine entscheidende Rolle im Stoffwechsel, in der Strukturbiologie sowie bei der Energiespeicherung. Daher ist die Analyse dieser speziellen Art von Kohlenhydraten von großem Interesse für die Lebensmittelindustrie, aber auch für ein breites Spektrum von Lebens- und Materialwissenschaften. Das Vorhandensein von Hydroxylgruppen ermöglicht eine spezifische und hochempfindliche Analyse unter Verwendung der gepulsten amperometrischen Detektion (PAD) mit dem elektrochemischen Detektor als Teil des Hochleistungs-Anionenaustauschchromatografie-Systems (HPAEC).
Verschiedene Arten von Monosacchariden können aus Lebensmitteln wie Honig [1] oder Früchten stammen. Auch können sie bei wissenschaftlichen Anwendungen z.B. mit Glykopeptiden oder als Produkte von Fermentationsprozessen entstehen, wie die hier zu analysierenden Holzmonosaccharide. Die Mischung aus den sieben Hemicellulose-Zuckern Fucose, Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Xylose und Mannose sowie den beiden Uronsäuren Galacturonsäure und Glucuronsäure (Abb. 1), die durch Hitze oder chemische Vorbehandlung aus Holz gewonnen werden, ist von besonderem Interesse für die Forschung über neue Biokraftstoffe. Diese Art von Biokraftstoffen der dritten Generation gelten als nachhaltiger und werden voraussichtlich eine wettbewerbsfähige kommerzielle Alternative zu Kraftstoffen aus Mais und anderen Nahrungsmitteln sein [2]. Kohlenhydrate sind schwache Säuren mit pKa-Werten zwischen 12 und 14. Sie können daher unter basischen Bedingungen mit einem pH-Wert > 12 ganz oder teilweise deprotoniert werden. Aufgrund dieser harschen Bedingungen sind nur polymere Anionenaustauschsäulen für die Monosaccharidanalyse geeignet. Die erreichte Retentionszeit während der HPAEC korreliert invers mit dem pKa-Wert und steigt mit dem Molekulargewicht des Monosaccharids signifikant an.
 
Ergebnisse
Bei dieser Applikation konnten alle neun Komponenten eines Holzmonosaccharid-Standardgemisches mit einer Analytkonzentration von 0,1 mg/ml basisliniengetrennt werden (Rs > 1,5) (Abb.

2). Die Auftrennung der Analytpeaks nahm mit abnehmender Probenkonzentration zu. Die beiden Monosaccharide Xylose (6) und Mannose (7) konnten bei Konzentrationen von mehr als 0,1 mg/mL nicht basisliniengetrennt werden. Das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) für jeden Analyten wurde aus empirischen Daten berechnet (Tab. 1). Für diese Konzentration wurden Rauschwerte aus zwei verschiedenen Basislinienbereichen ermittelt. Für die Monosaccharidzucker 1–7 wurde das gemittelte Rauschen mit 0,001 µA und für die Uronsäuren 8–9 ein Wert von 0,1 µA bestimmt. Konzentrationskurven aller Analyten von 0,0125 bis 0,25 mg/mL sind in Abb. 3 dargestellt.

 
Material und Methoden
Bei dieser Methode wurde ein glas- und metallfreies Hochleistungs-Anionenaustauschchromatografie-System (HPAEC) verwendet. Es bestand aus einer Azura P 6.1L LPG-Pumpe, einem Autosampler und einem elektrochemischen Detektor Azura ECD 2.1, der auch für die Säulentemperierung verwendet wurde (Tab. 2). Die Analyse basierte auf einem Stufengradienten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Natronlauge (Tab. 3). Während des Arbeitens mit geringen Konzentrationen von NaOH können Carbonationen, die in der mobilen Phase vorhanden sind, an das Säulenmaterial binden und dadurch die Trennleistung verringern. Daher ist für jeden Lauf eine Säulenregeneration mit höheren NaOH-Konzentrationen zu empfehlen. Um die Verunreinigung durch Carbonationen zu vermeiden, ist während der Herstellung der Eluenten die Verwendung einer carbonatfreien 50 %-igen (w/w) NaOH-Lösung (im Handel erhältlich) sowie die vorherige Entgasung durch Ultraschall empfehlenswert. Die Eluenten sollten täglich vollständig erneuert werden. Im Hinblick auf die hohe Empfindlichkeit des Detektors und die ätzende Wirkung von NaOH sollten nur Eluentenflaschen aus Kunststoff, Lösungsmittelansaugfilter aus Kunststoff und metallfreie Systemkomponenten verwendet werden, um den Nachweis unerwarteter Ionen, Silikate oder Borate zu verhindern. Zur Detektion wurde eine Sencell mit Gold-Arbeitselektrode, Hyref-Referenzelektrode (Pd/H2) und Edel­stahl-Hilfselektrode mit einer 4-stufigen Potentialwellenform verwendet (Abb. 4).
 
Fazit
Hochleistungs-Anionenaustauschchromatografie (HPAEC) mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD) unter Anwendung der entwickelten Methode ermöglicht die hochempfindliche Analyse von Zuckermonosacchariden und anderen Kohlenhydraten. Das Gemisch aus sieben Monosacchariden und zwei Uronsäuren konnte mit sehr hohen Signal/Rausch-Verhältnissen (S/N) basisliniengetrennt werden. Die einfach durchzuführende Methode mit unterschiedlichen NaOH-Konzentrationen eignet sich für eine schnelle und reproduzierbare Analyse auch bei geringen Konzentrationen. Neben der Erforschung von Biokraftstoffen sind die untersuchten Zucker auch Bestandteile zahlreicher Prozesse in Natur- und Lebensmittelanwendungen. Somit eignet sich diese Applikation für verschiedene Bereiche, in denen Kohlenhydrate spezifisch getrennt und analysiert werden müssen.
 
 
Autoren
Kristin Folmert1, Jan Wendrich1, Kate Monks1
 
 
Zugehörigkeiten
1Knauer Wissenschaftliche Geräte, Berlin, Deutschland

 

Kontakt   
Kate Monks

Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH
Berlin, Deutschland
applications@knauer.net

 

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Literatur:

[1]        H. Schlicke, K. Monks, Determination of sugars in honey using HILIC separation and RI detection, KNAUER AppNote VFD0161, 2017.

[2]        M. J. González-Muñoz, R. Alvarez, V. Santos, J. C. Parajó, Production of hemicellulosic sugars from Pinus pinaster wood by sequential steps of aqueous extraction and acid hydrolysis, Wood Science and Technology, 2012, 46, 1–3, 271–285. DOI: 10.1007/s00226-011-0408-0

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