Antibiotikaresistenzen verstehen

Fluoreszenzfarbstoff vereinfacht Analyse der Überlebensstrategien von Krankheitserregern

  • Abb. 1: Links: chemische Struktur von TramTO. Rechts: leuchtmarkierte Bakterien, welche mittels TramTO angefärbt und am konfokalen Live-Fluoreszenzmikroskop im roten Wellenlängenbereich sichtbar gemacht wurden. Abb. 1: Links: chemische Struktur von TramTO. Rechts: leuchtmarkierte Bakterien, welche mittels TramTO angefärbt und am konfokalen Live-Fluoreszenzmikroskop im roten Wellenlängenbereich sichtbar gemacht wurden.
  • Abb. 1: Links: chemische Struktur von TramTO. Rechts: leuchtmarkierte Bakterien, welche mittels TramTO angefärbt und am konfokalen Live-Fluoreszenzmikroskop im roten Wellenlängenbereich sichtbar gemacht wurden.
  • Abb. 2: Links: schematische Darstellung der Färbung von Bakterien mittels 6-TramTO-3 zur Untersuchung der Interaktion mit menschlichen Zellen, wie etwa Immunzellen. Rechts: Mikroskopische Aufnahme einer menschlichen großen Fresszelle (Makrophage), welche mit einem TramTO-markierten Bakterium (rot) interagiert.

Die exzessive Verwendung antibakterieller Medikamente in der Medizin und Tierhaltung hat in den vergangenen Jahren dazu geführt, dass sich vermehrt antibiotikaresistente Bakterienstämme herausgebildet haben. Besonders gefährlich wird diese Entwicklung, wenn krankheitserregende Keime, welche in der Vergangenheit gut auf Antibiotika ansprachen, Resistenzen entwickeln und somit schwer in den Griff zu bekommende Infektionen auslösen [1,2].

Im Fall Lungenentzündung auslösender Bakterien, wie etwa den Klebsiellen, haben sich mittlerweile Resistenzen gegen sämtliche gängige Antibiotika herausgebildet, was eine effektive Behandlung der betreffenden Patienten zunehmend erschwert. Um der gegenwärtigen Antibiotikakrise beizukommen hat die Weltgesundheitsorganisation der Erforschung dieser Bakterien höchste Priorität eingeräumt [3]. Allerdings stehen oft nicht die geeigneten Werkzeuge zur Verfügung, um die krankmachenden Strategien multiresistenter bakterieller Erreger zu untersuchen.

Interaktionen von Mikroorganismen mit Zellen des Immunsystems

Bakterielle Infektionen werden üblicherweise durch das Immunsystem abgewehrt oder in Schach gehalten. Einige Erreger haben jedoch gelernt, der Immunabwehr auszuweichen und können langwierige Infektionen und damit assoziierte Komplikationen verursachen. Um die Überlebensstrategien von Krankheitserregern zu verstehen ist es zunächst notwendig, zu untersuchen, wie die Mikroorganismen mit Zellen des Immunsystems interagieren. Ein gängiger Ansatz ist dabei die Leuchtmarkierung der Bakterien, wodurch diese mittels Techniken wie hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie sichtbar gemacht werden, um deren Interaktion mit menschlichen Zellen detailliert studieren zu können. In der Vergangenheit wurden die Bakterien zu diesem Zweck gentechnisch so verändert, dass sie Leuchtproteine wie z. B. das Green Fluorescent Protein (GFP) bilden [4-6]. Infizierte humane Wirtszellen, welche mit den fluoreszierenden Bakterien interagieren, wurden dann mittels Fluorecence Activated Cell Sorting (FACS) visualisiert und angereichert, um das Zusammenspiel von Wirt und Pathogen im Detail zu studieren.

Diese FACS-basierte Strategie wurde etwa kürzlich eingesetzt, um die genetischen Programme aufzudecken, über welche der bakterielle Pathogen Salmonella Typhimurium verfügt, um eine Infektion zu etablieren und die Immunantwort des Wirtes zu seinen Gunsten zu manipulieren [4].

Während die Markierung mit Fluoreszenz-Proteinen die Untersuchung der krankheitsauslösenden Strategien von Bakterien zweifellos vereinfacht hat, ist dieser Ansatz nicht auf alle Bakterienstämme anwendbar. Tatsächlich ist das Einbringen von Fremdgenen, etwa dem GFP-Gen, in Bakteriengenome i. d. R. ein sehr ineffizienter Prozess, so dass nur äußerst wenige Bakterien einer Wachstumskultur am Ende die gewünschte genetische Veränderung aufweisen. Um nun die wenigen Bakterien anreichern zu können, welche das Fremdgen, also z. B. ein GFP-Gen, tragen, wird i. d. R. ein Antibiotikaresistenzgen daran gekoppelt. Denn dadurch können mittels Antibiotikazugabe alle Bakterien, welche kein Fremdgen aufgenommen und in ihre DNA eingebaut haben abgetötet werden. Oder in anderen Worten: es überleben nur jene Bakterien, welche das Fremdgen (zusammen mit der Information für die Antibiotikaresistenz) aufgenommen haben. Ein wesentlicher Nachteil dieses Standardverfahrens zur Leuchtmarkierung von Bakterien ist allerdings, dass es nur in Bakterienstämmen funktionieren kann, welche nicht zuvor bereits antibiotikaresistent waren. Außerdem ist das Verfahren für eine Implementierung in der klinischen Routine viel zu zeitaufwendig.

Leuchtmarkierung von Bakterien

Nun konnte der im Folgenden präsentierte Ansatz entwickelt werden, welcher eine zuverlässige und schnelle Leuchtmarkierung von Bakterien ohne deren gentechnische Veränderung erlaubt [7]. Ein wesentlicher Vorteil ist dabei, dass dieses Verfahren auch für solche Bakterien funktioniert, welche multiresistent gegen Standardantibiotika sind. Dabei wird ein neuartiger Fluoreszenzfarbstoff, 6-TramTO-3, eingesetzt.
Bei 6-TramTO-3 handelt es sich um einen sogenannten Cyanin-Farbstoff, welcher in seiner chemischen Struktur hinsichtlich Eigenschaften wie Löslichkeit und Toxizität verbessert wurde. Der neue Farbstoff emittiert zudem in einem roten Wellenlängenbereich, welcher eine robuste Detektion an gängigen Mikroskopen und Durchflusszytometern erlaubt. Die Leuchtmarkierung der Mikroorganismen erfolgt nun durch einfache Zugabe des 6-TramTO-3-Farbstoffes zu bakteriellen Lebendkulturen. Exemplarisch konnte eine schnelle und langanhaltende Fluoreszenzmarkierung von verschiedenen Keimen wie Escherichia coli oder multiresistenten Klebsiellen gezeigt werden, ohne dass die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen eingeschränkt wurde. Dies sind entscheidende Vorteile gegenüber zuvor verfügbaren Farbstoffen, welche eine nur kurzlebige Leuchtmarkierung erlaubten oder auf die Mikroorgansimen stark toxisch wirkten, so dass deren Überlebensstrategien nicht hinreichend studiert werden konnten.

Exemplarisch wurde des Weiteren anhand von 6-TramTO-3-markierten Bakterien die Interaktion von Antibiotika-sensitiven und -resistenten Klebsiellen mit menschlichen Immunzellen verglichen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass beide Klebsiellenstämme von den Immunzellen schlechter aufgenommen werden als nicht-krankheitsauslösende E. coli Bakterien. Darüber hinaus stellte sich heraus, dass die Antibiotika-sensitiven Klebsiellen anders mit den großen Fresszellen des Immunsystems interagieren als die -resistenten Bakterien: während die Antibiotika-resistenten Klebsiellen noch mit verringerter Rate aufgenommen wurden konnte für den -sensitiven Stamm kaum mehr eine Aufnahme in die Immunzellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend legt dies nahe, dass Klebsiellen der Aufnahme und Zerstörung durch Immunzellen entgehen können, wobei Antibiotika-empfindliche und -unempfindliche Stämme diese Fähigkeit in unterschiedlichem Maße nutzen. Dieses Wissen könnte zur Behandlung von infizierten Patienten gezielt genutzt werden.

Ausblick
In der Zukunft könnte TramTO dazu eingesetzt werden, die Interaktion von aus Patienten isolierten Bakterien mit menschlichen Zellen schnell und tiefgreifend zu analysieren, um passgenaue Behandlungsstrategien zu ermöglichen, welche die speziellen krankmachenden Strategien der Keime berücksichtigen. Da gezeigt werden konnte, dass TramTO seine volle Leuchtkraft erst nach Bindung an die DNA von Organismen entfaltet sind weitere Anwendungen, etwa im Bereich der Nukleinsäurefärbung denkbar. Derzeit wird noch nach passenden Industriepartnern gesucht, um 6-TramTO-3 einer breiteren Forschergemeinschaft verfügbar zu machen.

Autoren: 
Leon N. Schulte und Olalla Vazquez

Kontakt
Jun. Prof. Leon Schulte
Institut für Lungenforschung
Philipps-Universität Marburg
Marburg, Deutschland
leon.schulte@staff.uni-marburg.de

Jun. Prof. Olalla Vázquez
FB Chemie
Philipps-Universität Marburg
Marburg, Deutschland
vazquezv@staff.Uni-Marburg.de
 

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Literatur:

[1] Levy, S.B. and B. Marshall, Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat Med, 2004. 10(12 Suppl): p. S122-9.

[2] Peleg, A.Y. and D.C. Hooper, CURRENT CONCEPTS Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria. New England Journal of Medicine, 2010. 362(19): p. 1804-1813.

[3] WHO, Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance. 2014.

[4] Westermann, A.J., et al., Dual RNA-seq unveils noncoding RNA functions in host-pathogen interactions. Nature, 2016. 529(7587): p. 496-501.

[5] Valdivia, R.H., et al., Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of host-pathogen interactions. Gene, 1996. 173(1): p. 47-52.

[6] Schulte, L.N., et al., Analysis of the host microRNA response to Salmonella uncovers the control of major cytokines by the let-7 family. EMBO J, 2011. 30(10): p. 1977-89.

[7] Schulte, L.N., et al., A Far-Red Fluorescent DNA Binder for Interaction Studies of Live Multidrug-Resistant Pathogens and Host Cells. Angew Chem Int Ed Engl, 2018.

 

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Philipps-Universität Marburg
Hans-Meerwein-Straße 2
35043 Marburg
Philipps-University of Marburg


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