Architektur flexibler Multiproteinkomplexe des Kinetochors

Kombination moderner Massenspektrometrieverfahren und Röntgenkristallographie

  • Abb. 1: A. Nanoflow-MS-Spektrum von COMA; B. Tandem-MS-Spektrum mit gaskollisions-induzierter Fragmentierung von COMA. Reproduziert von Schmitzberger et al, The EMBO Journal (2017) 36(23):3458–3482, unter CC BY4.0 Lizenz.Abb. 1: A. Nanoflow-MS-Spektrum von COMA; B. Tandem-MS-Spektrum mit gaskollisions-induzierter Fragmentierung von COMA. Reproduziert von Schmitzberger et al, The EMBO Journal (2017) 36(23):3458–3482, unter CC BY4.0 Lizenz.
  • Abb. 1: A. Nanoflow-MS-Spektrum von COMA; B. Tandem-MS-Spektrum mit gaskollisions-induzierter Fragmentierung von COMA. Reproduziert von Schmitzberger et al, The EMBO Journal (2017) 36(23):3458–3482, unter CC BY4.0 Lizenz.
  • Abb. 2: Schematische Darstellung der HDx-Experimente, illustriert am Beispiel von Ctf19 und Mcm21 in COMA im Vergleich mit dem von Ctf19 und Mcm21 in Ctf19-Mcm21.
  • Abb. 3: HDx-Daten von Okp1. Die Nummern am oberen Ende der Abbildung bezeichnen Positionen der Okp1-Aminosäurensequenz. Reproduziert von Schmitzberger et al, 2017, The EMBO Journal (2017) 36(23):3458–3482, unter CC BY4.0 Lizenz.
  • Abb. 4: A. HDx-Daten von Ctf19 und Mcm21, die auf die Ctf19-Mcm21-Kristallstruktur projiziert sind; links: HDx-Daten von Ctf19 und Mcm21 in COMA; rechts: HDx Daten von Ctf19 und Mcm21 in Ctf19-Mcm21. B. Kristallstruktur von Ctf19-Mcm21-Okp1. Reproduziert von Schmitzberger et al, 2017, The EMBO Journal (2017) 36(23):3458–3482, unter CC BY 4.0 Lizenz.

Wenn sich biologische Zellen von eukaryotischen Lebewesen teilen, werden deren Chromatide oder Chromosomen auf die entstehenden Tochterzellen aufgeteilt. Für diese Aufteilung ist das Kinetochor von entscheidender Bedeutung.

Kinetochore, die sich in Backhefe an den Zentromeren jedes Chromosoms aufbauen, verbinden die Chromosomen mit Mikrotubuli, mit deren Hilfe die Chromosomen in die Tochterzellen bewegt werden [1]. Obwohl die Chromosomenverteilung ein dynamischer Prozess ist, findet sie in menschlichen Zellen mit erstaunlich hoher Verlässlichkeit statt. Dies ist entscheidend, da ein ausgewachsener menschlicher Körper aus etwa 37 Billionen Zellen besteht. Abweichungen im Prozess der Chromosomenverteilung können zu Aneuploidie führen. In Menschen ist Aneuploidie Ursache genetisch bedingter physiologischer Symptome wie Down Syndrom und charakteristisch für Krebszellen. Auch deshalb ist es wichtig, die Funktionsweise des Kinetochors im Detail zu verstehen.

Das Kinetochor von Backhefe besteht aus ca. 45 unterschiedlichen Proteinen. Diese fügen sich in einer spezifischen, durch intermolekulare Bindungsstellen definierten Anordnung zusammen. Viele dieser Proteine verbinden sich zu stabilen Untereinheiten, den Multiproteinkomplexen [2]. Die meisten der Kinetochorproteine der Backhefe finden sich in ähnlicher Art in Menschen [3]. Deshalb sind Erkenntnisse, die am Kinetochor von Hefe gewonnen werden, für das Verständnis des menschlichen Kinetochors relevant. Um die mechanistische Funktionsweise des Kinetochors zu verstehen, ist eine detaillierte Kenntnis der Zusammensetzung und dreidimensionalen (3D) Struktur seiner Proteine notwendig.

Nanoflow-Elektrosprayionisations­massenspektrometrie (Nanoflow-MS)

Untersucht wurde in der im Folgenden beschriebenen Studie ein Komplex des inneren Kinetochors von Backhefe (COMA), der aus den Proteinen Ame1, Ctf19, Mcm21 und Okp1 besteht. Mit PCR-basierten Methoden wurden Genkonstrukte für die Proteine von dem der Backhefe ähnlichen Hefestamm Kluyveromyces lactis in ein pET-Plasmid kloniert. Mit diesem Plasmidkonstrukt wurde COMA von einem einzigen mRNA-Strang in bakterieller Zellkultur produziert.

Die gemeinsame Proteinproduktion war wichtig, da Proteine des Kinetochors oft nicht stabil sind oder sich nicht vollständig falten, wenn ihr unmittelbarer Bindungspartner nicht präsent ist.

In Vorarbeiten wurde die Kristallstruktur zweier miteinander verbundener COMA-Proteine, Ctf19 und Mcm21, bestimmt [4]. Im nächsten Schritt sollte die Struktur des gesamten COMA (142 kDa) oder von COMA gebunden an zwei andere Kinetochor-Proteine Nkp1 und Nkp2 (COMA-Nkp1-Nkp2) bestimmt werden. Von Kristallen, die von COMA oder COMA-Nkp1-Nkp2 gezüchtet wurden, konnten allerdings keine guten Röntgendiffraktionsdaten gesammelt werden. Auch mit Elektronenmikroskopie wurden keine aufschlussreichen Daten gesammelt. Zur Bestimmung der Anordnung der Proteine in COMA-Nkp1-Nkp2 wurde stattdessen  Nanoflow-MS im Tandemmodus mit kollisionsinduzierter Dissoziation in der Gasphase (CID) oder, nach partieller Dissoziation mit organischen Lösungsmitteln, eingesetzt. Durch technische Fortschritte ist es heute möglich, große, dynamische Multiproteinkomplexe im gefalteten, nicht denaturierten Zustand in die Gasphase zu überführen [5]. Durch Analyse der Zusammensetzung unterschiedlicher Arten massenspektrometrisch identifizierter COMA-Unterkomplexe wurde festgestellt, dass in COMA alle anderen Proteine Okp1 kontaktieren, während Ame1 nur Okp1 kontaktiert (Abb. 1).

Wasserstoff-Deuteriumaustausch gekoppelt an Massenspektrometrie (HDx)

Um die Kontaktstellen zwischen den Proteinen und die flexiblen Proteinstellen in COMA-Nkp1-Nkp2  im gefalteten Zustand in Lösung zu identifizieren, wurde HDx angewandt. Die Geschwindigkeit des Austausches unterschiedlicher Proteinteile hängt vom Bindungszustand der Amid-Wasserstoffe in der Peptidbindung ab. Amid-Wasserstoff, der Wasserstoffbrücken in Sekundärstrukturen (α-Helix, β-Strand) eingeht, tauscht sich langsam aus; jener in unstrukturierten flexiblen Teilen schnell. Das Ausmaß des Austausches mit Deuterium wurde mit MS der Pepsin-proteolysierten, mit Deuterium ausgetauschten Proteinkomplexe bestimmt. Fortschritte in der Sensitivität der Massenspektrometrie, wie durch die Ionenmobilitätsspektrometrie, ermöglichen die Anwendung von HDx auf große Multiproteinkomplexe [6]. Spezifische Protein-Proteinbindungsstellen wurden durch Unterschiede im Wasserstoffaustausch in den COMA-Nkp1-Nkp2-Proteinen in unterschiedlichen Komplexen gefunden [Abb. 2]. Dazu wurden HDx-Spektren von Peptiden der COMA-Nkp1-Nkp2-Proteine im gesamten COMA-Nkp1-Nkp2 mit denen von Peptiden in Unterkomplexen von COMA-Nkp1-Nkp2 (z. B. Okp1 in COMA-Nkp1-Nkp2 vs. Okp1 in COMA) verglichen [Abb. 3]. Voraussetzung dafür war, dass unterschiedliche Arten von Unterkomplexen (z. B. Ctf19-Mcm21-Okp1), die jeweils nur bestimmte Proteine beinhalteten, rekombinant produziert werden konnten.

Proteinkarte

Mit dem Wissen der Kontaktstellen und der Proteinanordnung wurde eine konzeptionelle Karte der Proteine im COMA-Nkp1-Nkp2-Komplex angefertigt. Alle COMA-Proteine haben größere unstrukturierte, flexible Elemente, die eine regelmäßige Proteinanordnung im Kristall verhindern, was die Kristallisationsprobleme und den fehlenden Kontrast in der Elektronenmikroskopie erklären.

Proteindesign für Bestimmung der Kristallstruktur

Die erstellte Proteinkarte wurde verwendet, um Proteinvarianten von Okp1 zu entwerfen, die die Kontaktstellen für Ctf19 und Mcm21 beinhalteten, aber über kaum flexible Proteinteile verfügen. Von mit einer solchen Proteinvariante produziertem, verkleinertem Ctf19-Mcm21-Okp1, der das Bindungssegment für Ctf19-Mcm21 beinhaltet, wurden Kristalle gezüchtet. Von diesen wurden mit Synchrotronröntgenstrahlung hochauflösende Daten (2.1 Å) gesammelt. Die Bestimmung der 3D-Struktur dieses Ctf19-Mcm21-Okp1-Komplexes verifizierte eindrucksvoll die Kontaktstellen, die mit HDx bestimmt worden waren [Abb. 4].

Kinetochorarchitektur - flexibel und robust

Die ermittelten Daten geben Einblicke in die Architektur des inneren Kinetochors. Einige Kinetochor-Proteine, sogenannte molekulare Nexus, haben mehrere Kontaktstellen für weitere Kinetochor-Proteine, die durch flexible, unstrukturierte Elemente separiert sind. Mit den Kontaktstellen verbinden sich die Nexus fest mit Kinetochor-Proteinen, die eine globuläre Struktur haben. Es wird vermutet, dass diese Verbindungen durch die Nexus sowohl eine hohe Flexibilität des Kinetochors als auch eine robuste Verbindung des Chromosoms mit dem Mikrotubulus durch das Kinetochor gewährleistet. Flexibilität gewährleitet die Anpassung des Kinetochors an die großen Änderungen und physischen Belastungen während der Chromosomenbewegungen; Robustheit ist notwendig, damit der Prozess der Chromosomenverteilung mit hoher Verlässlichkeit abläuft.

Analyse dynamischer Multiproteinkomplexe

Die Kombination von Daten aus Nanoflow-MS, HDx und Röntgenstrukturaufklärung ermöglichte die Erstellung einer Proteinkarte und hochauflösenden 3D-Struktur eines sehr flexiblen Multiproteinkomplexes. Erst die Kombination gewährte Einblicke in dieses System, dessen Struktur aufgrund seiner Dynamik schwer zu untersuchen ist. HDx ist besonders sensitiv, um intermolekulare Bindungsstellen in Multiproteinkomplexen zu bestimmen.

Viele dynamische Multiproteinkomplexe lassen sich nicht direkt mit 3D-bildgebenden Verfahren, wie Röntgenstrukturanalyse oder Elektronenmikroskopie, visualisieren. Die Tendenz in der Strukturbiologie ist deshalb die zunehmende Integration von Daten, die mit unterschiedlichen experimentellen biophysikalischen Techniken gewonnen werden. Diese Integration ermöglicht erst die Anfertigung ganzheitlicher 3D-Modelle. Es ist zu erwarten, dass die in diesem Artikel beschriebene, komplementäre Methodik nützlich für die Analyse anderer, großer dynamischer Multiproteinkomplexe mit flexiblen Elementen sein wird.

Autoren
Florian Schmitzberger1,2,3, Magdalena M. Richter4,5, Yuliya Gordiyenko6,7, Carol V. Robinson6, Michał Dadlez4,8, Stefan Westermann2,3

Zugehörigkeiten
1Abteilung für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA
2Forschungsinstitut für Molekulare Pathologie (IMP), Wien, Österreich
3Abteilung Molekulare Genetik 1, Universität Duisburg-Essen, Essen, Deutschland
4Institut für Biochemie und Biophysik, Polnische Akademie der Wissenschaften, Warschau, Polen
5Abteilung für Genetik, Universität Cambridge, Cambridge, England
6Abteilung für Chemie, Physikalische und Theoretische Chemie, Universität Oxford, Oxford, England
7MRC Labor für Molekularbiologie, Cambridge, England
8Institut für Genetik und Biotechnologie, Abteilung für Biologie, Warschau Universität, Warschau, Polen

Kontakt 
Dr. Florian Schmitzberger
florian.schmitzberger@uni-due.de

Originalveröffentlichung zum Beitrag:

F. Schmitzberger, M. M. Richter, Y. Gordiyenko, C. V. Robinson, M. Dadlez, S. Westermann: Molecular basis for inner kinetochore configuration through RWD domain-peptide interactions, The EMBO Journal, 36, 3458-3482 (2017); DOI: 10.15252/embj.201796636.

Referenzen:

[1] A. Musacchio, A. Desai: A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function, Biology 6 (2017); DOI: 10.3390/biology6010005.

[2] P. De Wulf, A. D. McAinsh, P. K. Sorger: Hierarchical assembly of the budding yeast kinetochore from multiple subcomplexes, Genes & development 17 (2003), 2902-2921; DOI: 10.1101/gad.1144403.

[3] A. Schleiffer, M. Maier, G. Litos, F. Lampert, P. Hornung, K. Mechtler, S. Westermann: CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex, Nature cell biology 14 (2012), 604-613; DOI: 10.1038/ncb2493.

[4] F. Schmitzberger, S. C. Harrison: RWD domain: A recurring module in kinetochore architecture shown by a Ctf19-Mcm21 complex structure, EMBO reports 13 (2012), 216-222; DOI: 10.1038/embor.2012.1.

[5] M. Sharon, C. V. Robinson: The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes, Annual review of biochemistry 76 (2007), 167-193; DOI: 10.1146/annurev.biochem.76.061005.090816.

[6] G. F. Pirrone, R. E. Iacob, J. R. Engen: Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014, Anal Chem 87 (2015), 99-118; DOI: 10.1021/ac5040242.
 

Massenspektrometrie in der Arzneimittelforschung
 

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