Auf der Spur von Tausenden von Schwingungen

Weiterentwicklung der Infrarot-Spektroskopie

  • Durch Messung der spektralen Veränderungen von strategisch platzierten Azido-Markierungen (azF) können die Bewegungen des Rezeptors bei den einzelnen Aktivierungsschritten vom inaktiven Zustand R zum aktiven Zustand R* im Detail erforscht werden.

Proteine sind die molekularen Maschinen in den Zellen. Um ihre Funktionsweise verstehen zu können, ist es notwendig in sie hineinzusehen und die bei ihrer Arbeit ablaufenden Veränderungen auf einem molekularen Niveau verfolgen zu können. Dies ist möglich mit Hilfe von Infrarotspektroskopie, speziell der sog. Fourier-Transform Infrarot-Spektroskopie (FTIR), welche die Schwingungen der einzelnen chemischen Bindungen in einem Protein und deren Veränderungen während der Arbeit des Proteins detektieren kann.

Ein FTIR-Spektrum eines typischen Proteins setzt sich jedoch aus mehreren 10.000 Einzelschwingungen zusammen, so dass es mühsam und oft auch gar nicht möglich ist, die interessierenden Schwingungsbanden zu isolieren und zu identifizieren.

Azido-Gruppe als Sonde

Eine mögliche Lösung dieses Problems ist der Einbau von künstlichen Bausteinen in ein Protein mit speziell auf die spektroskopischen Anforderungen zugeschnittenen Eigenschaften. Die Azidogruppe beispielsweise besteht aus drei Stickstoffatomen, deren chemische Bindung in einem isolierten spektralen Bereich absorbiert. Dieser Bereich ist nicht von anderen Proteinschwingungen überlagert, und die Azido-Gruppe wäre somit eine für die Spektroskopie ideale Sonde. In einer Zusammenarbeit zwischen Dr. Shixin Ye und Dr. Thomas P. Sakmar von der Rockefeller University in New York, Dr. Xavier Deupi von der Universitat Autonoma in Barcelona und Dr. Reiner Vogel vom Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung an der Universität Freiburg ist es gelungen, diese Gruppe in den für das Sehen zuständigen Lichtrezeptor Rhodopsin, ein Membran-Protein, an verschiedenen Stellen gezielt einzubauen und ihre Veränderungen bei der Aktivierung des Rezeptors mit FTIR-Spektroskopie im Detail zu verfolgen.

FTIR-spektroskopische Untersuchungen

Hierbei wurde eine vor allem von Dr. Peter G. Schultz am Scripps Institute in La Jolla, USA, entwickelte Methode für die Anwendung an der sehr wichtigen Klasse der G Protein-gekoppelten Rezeptoren, zu denen auch das Rhodopsin gehört, erweitert. Während Zellen ihre Proteine normalerweise aus einem begrenzten Repertoire von Bausteinen, den natürlichen Aminosäuren, zusammenbauen, werden sie hier durch molekularbiologische Methoden dazu gebracht, an bestimmten Stellen gezielt eine künstliche Aminosäure einzubauen, p-Azido-Phenylalanin, welche die oben genannte Azido-Gruppe trägt.

Mit dieser Methode konnten erstmals Rezeptoren gewonnen werden, die an für die Aktivierung wichtigen Schaltpunkten des Proteins mit einer Azido-Gruppe markiert waren. FTIR-spektroskopische Untersuchungen ermöglichten es nun, das für die Aktivierung notwendige Aufbrechen und Schließen von elektrostatischen Schaltern innerhalb des Rezeptors durch die spektralen Veränderungen der maßgeschneiderten Sonden zu verfolgen. In einer ersten Studie wurden die mit Hilfe der FTIR Spektroskopie an Azido-markierten Rhodopsin gewonnenen Daten anhand bestehender Kristallstrukturen validiert.

Ein Protein bei der Arbeit

Die Aktivierung des Photorezeptors Rhodopsin erfolgt nicht augenblicklich mit der Absorption eines Photons, sondern über eine Reihe von Intermediaten, die letztendlich zum aktiven Rezeptorzustand führen. In jedem dieser Intermediate breiten sich die durch die Photoreaktion induzierten Veränderung weiter innerhalb des Rezeptors aus, bis dieser schließlich eine Konformation einnimmt, in der er wiederum nachgeschaltete Elemente der Signalübertragungskette aktivieren kann. Mit Hilfe der neu entwickelten Technik konnte nun Dr. Reiner Vogel mit seinen Kollegen die dabei ablaufenden strukturellen Veränderungen innerhalb der einzelnen Intermediate genauer untersuchen. Hierbei konnte insbesondere gezeigt werden, dass Bewegungen von kompletten Strukturelementen, sog. α-Helices, schon viel früher nach der Photoaktivierung auftreten als bisher angenommen wurde. Die an diesen Untersuchungen beteiligten Biophysiker sind zuversichtlich, dass diese an Rhodopsin gewonnenen Erkenntnisse auch unser Verständnis der Aktivierung anderer Rezeptoren dieser Klasse, wie z.B. Hormon-Rezeptoren, prägen werden. Eine weitere Stärke dieser Technik liegt darin, dass sie aufgrund ihrer Sensitivität für elektrostatische Veränderung komplementär zu bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Elektronenspin-Resonanz an Spin-Labeln, ist. Hierdurch wird das Methoden-Repertoire der Biophysik um eine wichtige Komponente erweitert.

Literatur:
[1] Ye S et al.: Nature Chemical Biology, 5:397-399 (2009)
[2] Ye S.: Nature, zur Veröffentlichung angenommen (2010)

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