Automatisierte CD-Spektroskopie: Proteinstrukturanalyse im Mikrotiterplatten-Maßstab

  • Automatisiertes Zirkulardichroismus-Spektropolarimeter: ermöglicht Strukturanalyse von Biomolekülen wie Proteinen oder Nukleinsäuren im Mikrotiterplatten-MaßstabAutomatisiertes Zirkulardichroismus-Spektropolarimeter: ermöglicht Strukturanalyse von Biomolekülen wie Proteinen oder Nukleinsäuren im Mikrotiterplatten-Maßstab

Strukturanalyse in Lösung entwickelt sich zunehmend zu einer Standardmethode bei der Charakterisierung von Biomolekülen. Ein wichtiger Meilenstein auf diesem Weg ist die hier vorgestellte Einbindung in Arbeitsabläufe, die im Mikrotiterplatten-Maßstab durchgeführt werden. Zirkulardichroismus-Spektroskopie (engl. circular dichroism, CD) ist dafür besonders geeignet, da sie für Änderungen in der Sekundärstruktur höchst sensitiv ist, mit geringen Probenkonzentrationen und –volumina auskommt, keine Markierung und vergleichsweise kurze Messzeiten erfordert und eine schnelle Datenauswertung ermöglicht.

CD-Spektroskopie
CD-Spektroskopie nutzt die Tatsache, dass nahezu alle biologisch relevanten Makromoleküle (z. B. Proteine und Nukleinsäuren) links und rechts zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich stark absorbieren. Dies ermöglicht beispielweise die Unterscheidung eines α-helikalen Proteins von einem, das hauptsächlich β-Faltblätter enthält oder dessen Polypeptidkette ungefaltet ist. Darüber hinaus kann die Änderung der Sekundärstruktur einer Probe in Abhängigkeit der Umgebung oder der Zeit bestimmt werden.

Automatisierte CD-Spektroskopie
CD-Spektroskopie stellt sehr hohe Anforderungen an die optischen Komponenten der Spektropolarimeter und die Verarbeitung der Küvetten. Zudem werden hochempfindliche und stabile Detektoren benötigt, um das vergleichsweise schwache CD-Signal aufzuzeichnen. Aus diesen Gründen waren bisher keine Mikrotiterplatten-Reader für die CD-Spektroskopie verfügbar. Einen Ausweg bietet nun die Firma Applied Photophysics, die ein CD-Spektropolarimeter mit einem Pipettierroboter kombiniert. Die Messung der Probe erfolgt in einer Durchflussküvette, die der Roboter füllt, leert und reinigt. Als Probenreservoir dienen Mikrotiterplatten, die entweder manuell oder durch den Roboter, der aus verschiedenen Stammlösungen mischen kann, befüllt werden.

Anwendungen
Automatisierte CD-Spektroskopie eignet sich besonders für Stabilitätstests und Interaktionsstudien. Beispielsweise lässt die thermische Stabilität (Tm) eines Biomoleküls bei verschiedenen Pufferbedingen Rückschlüsse auf dessen Langzeitstabilität zu.

Grundsätzlich ist Tm mit CD-Spektroskopie besonders zuverlässig bestimmbar, da die Signalstabilität kaum von der Temperatur und dem Lösungsmittel der Probe abhängt.

Zudem ermöglicht der Einsatz von Mikrotiterplatten in Kombination mit dem Roboter eine schnelle und effiziente Probenpräparation und somit eine automatisierte Untersuchung vieler verschiedener Pufferbedingungen. Eine weitere Anwendung sind Stabilitätstests von Proben, die über einen längeren Zeitraum gelagert werden sollen, bevor sie in biologischen Assays zum Einsatz kommen. Die Automatisierung vereinfacht auch Messungen von Protein–Protein oder Protein-Ligand-Wechselwirkungen, bei denen die Sekundärstruktur oder Tm eines Proteins in Anwesenheit verschiedener Interaktionspartner gemessen wird.

Der Vorteil dieser Messungen liegt darin, dass sie mit geringem Proben- und Zeitaufwand einen Überblick liefern, bevor hochauflösende Methoden zum Einsatz kommen, die größere Probenmengen oder eine spezielle Vorbereitung wie Markierung, Immobilisierung oder Kristallisation erfordern. Die Abteilung Molekulare Biophysik der Technischen Universität Kaiserslautern ist weltweit die erste akademische Einrichtung, die über ein automatisiertes CD-Spektropolarimeter verfügt. In Zusammenarbeit mit dessen Hersteller Applied Photophysics sollen über die hier vorgestellten Anwendungen hinaus neue Ansätze zur quantitativen Untersuchung der Proteinfaltung sowie zur Rekonstitution von Membranproteinen entwickelt werden.

 

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