Bakterielle Haftkraft

Wie man einzelnen Bakterien an den Kragen geht...

  • Abb. 1: Modell der Biofilmbildung nach [1].Abb. 1: Modell der Biofilmbildung nach [1].
  • Abb. 1: Modell der Biofilmbildung nach [1].
  • Abb. 2: Mikromanipulator mit Glasspitze (links) und Federtisch mit Bakterien besiedelten Polycarbonat-Probe (rechts) in REM-Umgebung installiert.
  • Abb. 3: Vereinfachtes Modell der bakteriellen Haftkraftmessung.
  • Abb. 4: Kraft-Zeit-Diagramm einer Haftkraftmessung an einer einzelnen E. coli-Bakterie.
Bakterien kommen ubiquitär vor und können sich nahezu an jeder Oberfläche anlagern. Dies bereitet bei vielen Anwendungen, besonders in sensitiven Bereichen wie der Lebensmittelindustrie oder in der Medizin, viele Probleme. Um zu überleben, bevorzugen Bakterien das Leben auf festem Untergrund. 
 
Am besten wird das deutlich am Beispiel eines Baches: Das Wasser ist glasklar, die Steine und der Untergrund sind mit Flechten und Moos besiedelt. Demnach bietet der sessile Existenzmodus eine Vielzahl an Vorteilen. Bakterien können sich untereinander unterstützen, indem sie sich gemeinsam in einem Gerüst sezernierter Extrapolymere Substanzen (EPS) kolonisieren. Diese Umgebung bietet Schutz vor äußeren Einflüssen wie UV-Strahlung, Konvektionen oder chemischen Substanzen (Antibiotika und Desinfektionsmittel) oder dient als Versorgungsnetzwerk mit Nährstoffen. Durch diesen Verbund entwickeln die Bakterien resistentere Eigenschaften und sind dadurch schwieriger restlos zu beseitigen. Doch wie kommt es zu einer Biofilmbildung? 
 
Bakterielle Primäradhäsion
Eine Bioadhäsion kann in fünf Schritte eingeteilt werden [1]. Die Bakterien gelangen durch aktive Bewegung mithilfe ihrer Geißeln, durch Strömung und Sedimentation oder durch Diffusion auf eine solide Oberfläche. Im ersten Schritt erfolgt eine reversible Anlagerung, die je nach Mikroorganismus innerhalb von Sekunden bis Stunden geschieht und durch schwache Haftkräfte wie van der Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, elektrostatische und schwache hydrophobe Wechselwirkungen gekennzeichnet ist. Während dieser Phase können Bakterien durch Scherkräfte, beispielsweise über Abspülen oder turbulente Strömung noch abgelöst werden. Nach der reversiblen Anlagerung erfolgen in der bakteriellen Zelle Vorgänge auf molekularer Ebene, die die irreversible Adhäsion einleiten, die ebenfalls Sekunden bis Stunden dauern kann. Hierbei sind kovalente und verstärkte hydrophobe Bindungen als auch die Verankerung der Fimbrien beteiligt. Die Bakterien sind nun an der Oberfläche angesiedelt (Primärbesiedlung) und bilden in einem weiteren Schritt Mikrokolonien aus.

Durch Ablösung von Tochterzellen aus den Mikrokolonien und erneute Anlagerung bildet sich ein flächendeckender Biofilm. Nach Ansiedelung auf der Oberfläche formen sich weitere Kolonien aus, bis die Oberfläche mit einer Schicht überzogen ist und sich schließlich ein Biofilm geformt hat (Abb. 1). Primäradhäsion in diesem Sinne bedeutet, dass Mikroorganismen

  • initial adhäriert sind, 
  • noch keinem Biofilm angehören, 
  • als eigenständiges System agieren, 
  • die repulsive Energiebarriere nach der DLVO-Theorie überwunden haben [2], 
  • noch typische Gene für die planktonische Lebensform besitzen und 
  • noch keine EPS typischen Substanzen extrazellulär ausgebildet haben. 
Die Erforschung des Stadiums Primäradhäsion ist somit sehr wichtig, da initial gebundene Bakterien das Bindeglied zwischen Oberfläche und anderen auf ihnen wachsenden Bakterien sind und somit Träger des ganzen Biofilms. Durch verzögerte bzw. verschlechterte Adhäsion der Mikroorganismen an einer Oberfläche kann die Biofilmbildung präventiv reduziert werden. 
 
Einflussgrößen der Primäradhäsion
Um eine Primäradhäsion im Labor nachzustellen, sind eine Vielzahl an Faktoren zu beachten: Umgebung, Mikroorganismus und Oberflächenbeschaffenheit des Materials. Bei der Umgebung ist die Wahl des richtigen Mediums ebenso entscheidend wie dessen Temperierung, pH-Wert und Scherkrafteinwirkung. Von der Art des Mikroorganismus hängt auch die Kultivierungszeit ab. Bei Pseudomonas aeruginosa wurden weitaus kürzere Adhäsionszeiten [1] festgestellt als bei Escherichia coli [3]. Die Zellwand interagiert mit der jeweiligen Oberfläche und leitet Prozesse in der Zelle ein, die sie stärker anhaften lassen. Ob die Oberfläche nun hydrohphil oder hydrophob sein sollte, darüber scheiden sich die Geister. Letztendlich ist es angesichts dieser Fülle an Parametern schwierig, alle Einflussgrößen allgemein gültig vorherzusagen.
 
Kultivierung zur Erreichung der Primäradhäsion
An der Hochschule Ansbach ist es gelungen, eine Kultivierung zu entwickeln, die E. coli JM109-Bakterien auf Polycarbonat-Flächen primär adhärieren lässt [4]. E. coli JM109 ist ein biofilmbildender Mikroorganismus, der zu dem Sicherheitsstamm K12 gehört und sich für Biofilmexperimente hervorragend eignet. Aufgrund der Transparenz und der thermischen Stabilität wurde Polycarbonat (PC) als Testmaterial herangezogen. Danach wurden nur noch die Kultivierungsbedingungen auf Herz und Nieren geprüft, bis letztendlich nach 6 h Kultivierungszeit eine Primäradhäsion definiert wurde, die sich als reproduzierbar erwies. 
 
Die Kunststoffprobekörper werden in einen Bioreaktor eingesetzt. Nach dem Animpfen mit den E. coli-Bakterien wird der Bioreaktor mit reinem Sauerstoff versorgt, der mit geringer Rührerdrehzahl in das Medium eingebracht wird. Das sorgt für die optimale Sauerstoffversorgung der Zellen bei geringer Scherkrafteinwirkung. 
 
Ermittlung der bakteriellen Haftkraft
Nach Ablauf der Kultivierung werden die Bakterien mit einer neuen Testmethode auf ihre Haftkraft überprüft. Hierfür gibt es schon zahlreiche Methoden, bei denen die Zellen angesaugt [5], abgeschert [6], angehoben [7] oder wie mit einer Schlingenfalle von der Oberfläche abgerissen [8] werden und Haftkräfte in Newton liefern. Jedoch ist jedes einzelne Verfahren durch die Kombination von Mikroorganismus und Substrat gekennzeichnet und untereinander schwierig zu vergleichen. Hinzu kommt, dass die Tests an immobilisierten, in Medium oder im trockenen Zustand befindlichen Zellen ausgeführt werden und die Richtung der Krafteinwirkung unterschiedlich ist. Die Krafteinwirkung wird oft durch ein Rasterkraftmikroskop (Atomic Force Microscope, AFM) senkrecht zur Oberfläche ausgeführt. Für die häufig eingesetzte Wischdesinfektion, bei der seitliche Schubkräfte parallel zur Oberfläche ausgeübt werden, fehlt ein Messverfahren. Diese Lücke soll nun mit einer speziellen Mikromanipulator-Vorrichtung gefüllt werden [9].
 
Hier kommt ein Mikroroboter ins Spiel (Abb. 2). Er hat drei Bewegungsachsen und arbeitet piezoelektrisch, wodurch Positioniergenauigkeiten von 0,5 nm möglich sind. Als Instrument wird eine Glasspitze eingesetzt, die einen Spitzenradius von 50 nm aufweist. Somit sind optimale Bedingungen gegeben um eine einzelne Bakterie punktgenau anzufahren und von der Oberfläche zu „schubsen“. Der Trick ist, dass der mit Bakterien besiedelte Probekörper auf einem Federtisch mit definierter Federkonstante befestigt ist und orthogonal zur Glasspitze ausgerichtet ist. Die Messung erfolgt nun live im Rasterelektronenmikroskop (REM) bei Feinvakuum und funktioniert wie folgt (Abb. 3): Die Glasspitze befindet sich ungefähr 200 nm oberhalb der Oberfläche und wird vor dem Bakterium positioniert. Nun wird die Glasspitze gegen das Bakterium gefahren, wobei sich der Federtisch durch die Krafteinleitung mitbewegt. Wird die maximale Haftkraft des Bakteriums überschritten, reißt das Bakterium von der Oberfläche ab und der Federtisch springt in seine Ursprungslage zurück. Über die Software kann dann die zurückgelegte Strecke ausgemessen werden. Aus den Daten kann nach dem Hookeschen Gesetz die bakterielle Haftkraft ermittelt werden und ein Kraft-Zeit-Diagramm erstellt werden (Abb. 4). Um einen Vergleich zu haben und verschiedene Oberflächenbeschaffenheiten zu testen, wurde z. B. neben einer unbehandelten Polycarbonatprobe auch eine plasmafluorierte PC-Probe getestet. Die vorläufigen Ergebnisse sprechen für sich:
 
Unbehandeltes PC: 96,6  ± 17,9 µN Haftkraft
Fluoriertes PC: 16,4 ± 5,1 µN Haftkraft
 
Auf unbehandelten PC konnten bis zu sechsmal höhere Haftkräfte ermittelt werden im Vergleich zum fluorierten PC. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fluorierung die Adhäsion der Bakterien stark beeinflusst. Die Quantifizierung der Oberflächenbesiedelung erfolgt mittels Digitaler Mikroskopie, die eine geringere Anzahl von anhaftenden Bakterien auf der fluorierten Probe ergibt. Jedoch muss die Anzahl von Bakterien auf den Oberflächen nicht zwingend von der Haftkraft abhängen. 
Mit der hier vorgestellten Methode können problematische Mikroorganismen bei der Lebensmittelverarbeitung im Hinblick auf ihre Primäradhäsion auf Materialoberflächen getestet werden. So kann durch geeignete Materialauswahl oder über organisatorische Maßnahmen (Reinigungsintervalle) der Hygienestatus optimiert werden. 
 
Das Forschungsvorhaben steckt noch in den Kinderschuhen, ist aber sehr vielversprechend. Ist das Verfahren zur Messung der mikrobiellen Haftkraft etabliert, könnte eine Datenbank erstellt werden, die die Haftkräfte einzelner Mikroorganismen auf verschiedenen Oberflächen zeigt, um zielgerichtet optimal an die Nutzungsbedingungen angepasste Oberflächen für hygienische Anwendungen auswählen zu können.
 
Gefördert durch ZIM – Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand, Projektcode KF2729603SK3.
 
Literatur
[1] George O'Toole, Heidi B. Kaplan, Roberto Kolter: Biofilm Formation as Microbial Development, Annual Review of Microbiology, Bd. 54, Nr. 1, S. 49–79 (2000), DOI: 10.1146/annurev.micro.54.1.49
[2] Mark C. van Loosdrecht, Johannes Lyklema, Willem Norde, Alexander J. B. Zehnder: Influence of Interfaces on Microbial Activity, Microbiological Reviews, Bd. 54, Nr. 1, S. 75–87, (1990)
[4] N. Stefani et al.: Applied Research Conference 2015, Nürnberg, Bd. 1, S. 532–536
[6] N. F. Owens et al.: Inhibition of cell adhesion by a synthetic polymer adsorbed to glass shown under defined hydrodynamic stress, J. Cell Sci., Bd. 87, Nr. 5, S. 667–675 (1987)
[7] M. R. Ahmad et al.: IEEE Trans. NanoBioscience, Bd. 11, Nr. 1, S. 70–78 (2012)
[8] P. H. Tsang et al.: Adhesion of single bacterial cells in the micronewton range, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 103, Nr. 15, S. 5764–5768, (2006)
Kontakt

Prof. Dr. Hans-Achim Reimann
Energie und Umweltsystemtechnik
Hochschule Ansbach

 

Artikel zum Thema Biofilme: http://www.biospektrum.de/
Mehr zur Anwendungen der Elektronenmikroskopie: http://www.imaging-git.com/science/electron-and-ion-microscopy

 

Jetzt registrieren!

Die neusten Informationen direkt per Newsletter.

To prevent automated spam submissions leave this field empty.