Biologische Wasserstoffproduktion

Algen liefern Wasserstoff nachhaltig aus Sonnenlicht

  • Abb. 1: Elektronentransfer im Chloroplasten der Alge C. reinhardtii, der zur Produktion von Wasserstoff oder anderer Stoffe führt. Hase = Hydrogenase, PS = Photosystem, PETF = Ferredoxin.Abb. 1: Elektronentransfer im Chloroplasten der Alge C. reinhardtii, der zur Produktion von Wasserstoff oder anderer Stoffe führt. Hase = Hydrogenase, PS = Photosystem, PETF = Ferredoxin.
  • Abb. 1: Elektronentransfer im Chloroplasten der Alge C. reinhardtii, der zur Produktion von Wasserstoff oder anderer Stoffe führt. Hase = Hydrogenase, PS = Photosystem, PETF = Ferredoxin.
  • Abb. 2: A) 1H, 15N-HSQC Spektrum des freien Ferredoxins mit sequenzspezifischer Zuordnung der Signale. B, C) Ausschnitte des 1H, 15N-HSQC Spektrums des Ferredoxins, in denen die Hauptunterschiede bei Interaktion mit Hydrogenase (B) und FNR (C) zu finden sind. Für ungebundenes Ferredoxin sind die Signale rot und für gebundenes Ferredoxin blau dargestellt.
  • Abb. 3: Lichtabhängige Wasserstoffproduktion durch Hydrogenase in Konkurrenz mit FNR im in vitro Test. Ferredoxin ist der Elektronendonor. Im Proflavintest (A) ersetzen Proflavin und EDTA das Photosystem I (PSI) (B).

Wasserstoff gilt als aussichtsreicher Energieträger der Zukunft, da bei seinem Verbrauch lediglich Wasser anstelle von CO2 entsteht. Allerdings kommt molekularer, gasförmiger Wasserstoff in der Natur nur zu einem extrem kleinen Teil vor. Größtenteils liegt der Wasserstoff in unerschöpflicher Menge in Form von Wasser vor.

Für die Herstellung von Wasserstoff aus Wasser können verschiedene Energiequellen und technische Verfahren zum Einsatz kommen. Außerdem stellen Mikroalgen prinzipiell Wasserstoff automatisch aus Wasser und Licht her. Da dieses mit Hilfe regenerativer Energie noch nicht in ausreichendem Maße und mit vertretbarem Aufwand möglich ist, wird Wasserstoff derzeit vor allem aus Erdgas gewonnen. Durch Fortschritte bei den Erkenntnissen über die in Mikroorganismen ablaufenden Prozesse zur Wasserstofferzeugung wird diese komplett regenerative Möglichkeit immer stärker diskutiert. Die Effizienz dieser photobiologischen Wasserstoffproduktion muss jedoch im Vergleich zum natürlichen Prozess noch um das zehn- bis hundertfache steigen, damit Biowasserstoff beim derzeitigen Marktpreis konkurrenzfähig wird.

Zur Optimierung der biologischen Wasserstoffproduktion gibt es zwei verschiedene Ansätze. Zum einen können Grünalgen für den Einsatz als direkte Wasserstoffproduzenten optimiert werden. Alternativ können die isolierten, Wasserstoff-produzierenden Enzyme so verändert werden, dass sie in einer für die Wasserstoffherstellung optimierten Designzelle effizient arbeiten. Hierzu sind, neben Grünalgen, Cyanobakterien am besten geeignet, da diese sowohl physiologisch als auch molekulargenetisch gut erforscht sind und ähnlich wie Grünalgen und höhere Pflanzen eine oxygene Photosynthese betreiben.

Grünalge Chlamydomonas reinhardtii
Einige einzellige Algen produzieren Wasserstoff direkt aus Wasser mit Hilfe von Sonnenlicht. Zu diesen Grünalgen gehört auch Chlamydomonas reinhardtii, die derzeit der leistungsfähigste biologische Wasserstoffproduzent ist. Normalerweise wandelt Chlamydomonas, wie höhere Pflanzen auch, Lichtenergie in chemische Energie in Form von Kohlenhydraten um.

Für diesen Vorgang der Photosynthese, der in den Chloroplasten abläuft, werden Wasser und CO2 benötigt und Sauerstoff freigesetzt. Unter Stress, beispielsweise durch Stickstoff- oder Schwefelmangel, stellen die Algen ihren Stoffwechsel um, sodass anaerobe Bedingungen entstehen und Lichtenergie im Rahmen der Photosynthese zur Wasserstoffproduktion benutzt wird. Zunächst spalten sie mit Hilfe der Lichtenergie Wasser und verteilen die dabei entstehenden Elektronen dann in der Zelle. Dafür ist das kleine eisenhaltige Protein Ferredoxin zuständig [1]. Dieses beliefert nicht nur das Wasserstoff produzierende Enzym Hydrogenase mit Elektronen, sondern auch viele andere Enzyme. Der Hauptakzeptor der Elektronen des Ferredoxins ist dabei die Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase (FNR), die NADPH für den Aufbau von Biomasse aus CO2 bereitstellt (Abb. 1). Hierbei ist der Elektronenfluss vom Ferredoxin zur FNR normalerweise effizienter als zur Hydrogenase. Eine Maßnahme um die Effizienz der biologischen Wasserstoffproduktion zu steigern ist also die Optimierung des Elektronenflusses vom Photosystem über das Ferredoxin zur Hydrogenase.

Wasserproduzierende Biokatalysatoren
Hydrogenasen katalysieren die reversible Übertragung von Elektronen auf Protonen, wobei über einen heterolytischen Mechanismus molekularer Wasserstoff entsteht. Diese Biokatalysatoren sind sehr leistungsfähige Enzyme, die bis zu 10.000 Moleküle Wasserstoff pro Sekunde erzeugen können. Damit das möglich ist, haben sie ein in der Natur einzigartiges aktives Zentrum. Dieses enthält sechs Eisenatome, von denen vier mit Schwefel ein kubisches Eisen-Schwefel-Cluster bilden. An das kubische Eisen-Schwefel-Cluster sind die anderen zwei Eisenatome über die Aminosäure Cystein gekoppelt. Diese zwei Eisenatome sind sehr speziell, denn sie koordinieren Kohlenstoffmonoxid- und Cyanid-Liganden und sind über eine Dithiolatbrücke miteinander verbunden. Die Produktion von Wasserstoff findet an dieser einzigartigen Zwei-Eisen-Einheit statt [2].

Die Hydrogenasen sind biotechnologisch vor allem für den Einsatz in Brennstoffzellen, beispielsweise als Ersatz für teure und seltene Edelmetalle wie Platin, und in einem artifiziellen System zur Wasserstoffproduktion interessant. In einem stoffwechselphysiologisch neu gestalteten biologischen System können die Bedingungen kontrolliert verändert werden. Besonders wichtig ist hierbei die Optimierung der Protein-Protein Interaktionen, die zum Elektronentransfer vom Photosystem I über das Ferredoxin zur Hydrogenase führen. Wie in Grünalgen, so kommt auch in einer cyanobakteriellen Designzelle der Veränderung des Ferredoxins als zentralem Elektronenmediator eine Schlüsselrolle zu.

Erkenntnisse mittels NMR-Spektroskopie
Eine Grundlage für die gezielte Veränderung des Elektronentransfers vom Ferredoxin zu seinen Interaktionspartnern Hydrogenase und FNR ist die Identifikation der dafür entscheidenden Aminosäuren des Ferredoxins. Diese Interaktionen können mit Hilfe der NMR-Spektroskopie mit atomarer Auflösung unter nahezu physiologischen Bedingungen untersucht werden. Von besonderer Bedeutung ist hierbei das sogenannte 1H,15N-HSQC-Spektrum, in dem die chemische Verschiebung von Protonen mit direkt gebundenem Stickstoff korreliert wird. Daher zeigt dieses Spektrum im Idealfall für jede Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ein Signal. Zuvor muss das Ferredoxin selektiv mit 15N markiert werden, da das natürlich vorkommende Stickstoffisotop (14N) NMR-inaktiv ist. Bindet die Hydrogenase oder FNR an das 15N-markierte Ferredoxin so verändern sich im 1H,15N-HSQC-Spektrum nur die Signale derjenigen Aminosäuren, die mit der Hydrogenase oder der FNR wechselwirken. Vergleicht man die Aminosäuren des Ferredoxins, welche mit der Hydrogenase interagieren mit denjenigen, die an der Wechselwirkung mit FNR beteiligt sind, können auch die Unterschiede im Erkennungsmuster der beiden Konkurrenten identifiziert werden. Unter allen 94 Aminosäuren des Ferredoxins gibt es zwei, deren Signal sich zwar bei Bindung der FNR nicht jedoch bei Kontakt mit der Hydrogenase verändern. Bei beiden handelt es sich um die negativ geladene Aminosäure Aspartat (Abb. 2).

Steigerung der biologischen Wasserstoffproduktion
Durch genetische Veränderungen können Aminosäuren gezielt ausgetauscht werden. Im Falle des Ferredoxins wurden die beiden NMR-spektroskopisch identifizierten Aspartate zur ungeladenen Aminosäure Alanin ausgetauscht. Die lichtabhängige Wasserstoffproduktion der Hydrogenase wurde dann mit den verschiedenen Ferredoxinen bei Anwesenheit des Konkurrenten FNR experimentell bestimmt. Dazu wurde die isolierte Hydrogenase, die jeweilige Ferredoxin-Variante und FNR aus Chlamydomonas mit Proflavin als Ersatz für Photosystem I und EDTA als Elektronenlieferant kombiniert und die Wasserstoffbildung gaschromatographisch bestimmt. Für die Ferredoxin Varianten ist aufgrund des Austausches von Aspartat zu Alanin die Interaktionsfähigkeit mit der FNR herabgesetzt. Hierdurch verschiebt sich das Konkurrenzverhältnis zwischen Hydrogenase und FNR um die vom Ferredoxin gelieferten Elektronen zugunsten der Hydrogenase, sodass mehr Wasserstoff im Vergleich zum Kontrolltest mit dem ursprünglichen Ferredoxin produziert wird. Wird eine Ferredoxin-Doppelmutante mit Alanin anstelle von Aspartat an beiden Positionen eingesetzt, so erhöht sich die Wasserstoffproduktion im Vergleich zum unveränderten Ferredoxin um den Faktor vier. Eine zusätzliche Veränderung einer positiv geladenen Aminosäure der FNR führt unter gleichen Bedingungen zu einer fünffach gesteigerten Menge an Wasserstoff (Abb. 3A).

Um mit dem in vitro Test so genau wie möglich die Situation in der lebenden Algenzelle zu untersuchen, wurde statt Proflavin und EDTA das aus C. reinhardtii isolierte Photosystem I eingesetzt. Eine ähnliche Steigerungswirkung des veränderten Ferredoxins auf die lichtgetriebene Wasserstoffproduktion konnte auch hier beobachtet werden (Abb. 3B) [3].

Die in vitro erreichte Steigerung der Wasserstoffproduktion könnte zukünftig auch in vivo erreicht werden. Entsprechende Untersuchungen an genetisch veränderten Chlamydomonas reinhardtii-Kulturen sind allerdings derzeit wegen der Schwierigkeiten, gerichtete Austausche im Algen-Kerngenom vorzunehmen, kaum möglich. Zwar können Varianten der Gene von Ferredoxin und FNR ins Genom integriert werden, aber die natürliche Genkopie bleibt erhalten. Deshalb überlagern die ursprünglichen Proteinformen jene Effekte der Ferredoxin- und FNR-Varianten, die unter in vitro Bedingungen stattfinden. Um auf diese Weise Algen selbst in ihrer Wasserstoffproduktionseffizienz zu optimieren, gilt es also zunächst die Möglichkeiten zur gezielten genetischen Modifikation des Kerngenoms zu verbessern.

Zusammenfassung und Ausblick
Mit der gezielten Manipulation des Elek­tronenmediators Ferredoxin kann man die natürlichen Elektronenübertragungswege zugunsten einer gewünschten Stoffwechselreaktion wie der lichtabhängigen Wasserstoffbildung umlenken. Eine gleichzeitige Veränderung von Ferredoxin und FNR ermöglicht außerdem eine additive Steigerung der Wasserstoffbildung durch die Hydrogenase. Bereits existierende C. reinhardtii Mutanten zeigen, dass die Zuleitung von Elektronen und damit das Volumen des gebildeten Wasserstoffs von einigen weiteren Einflussfaktoren abhängt [4]. Die systematische Optimierung und anschließende Kombination sämtlicher physiologischer „Stellschrauben" des Wasserstoffmetabolismus ist eine vielversprechende Strategie, um die Effizienz der biologischen Umwandlung von Lichtenergie zu Wasserstoff auf ein wirtschaftlich interessantes Niveau zu steigern [5].

Referenzen
[1] Winkler M. et al.: J. Biol. Chem. 284, 36620-36627 (2009)
[2] Lubitz W. et al.: Chem. Rev. 114, 4081-148 (2014)
[3] Rumpel S. et al.: Energ. Environ. Sci. 7, 3296-3301 (2014)
[4] Kruse O. et al.: J. Biol. Chem. 280, 34170-34177 (2005)
[5] Stephens E. et al.: Nat. Biotechnol. 28, 126-128 (2010)

 

Grundlagen der NMR-Spektroskopie: www.chemgapedia.de/vsengine

 

Autor(en)

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45470 Mülheim
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