Bioprozesstechnik: Herstellung von Enzymen

Maßstabsübertragung vom Laborprozess zur Pilotanlage

  • Abb. 1: Vorgehensweise zur Herstellung eines rekombinanten P. pastoris-Stammes zur Herstellung einer Lipase mit Perhydrolaseaktivität (PER1) im großtechnischen Maßstab. Nach der genomischen Integration des Expressionskonstruktes (AOX1-Promoter - Sekretionssignal (α) - Codon-optimierte Lipasesequenz – AOX1-Terminator) in den P. pastoris-Stamm und der Selektion geeigneter Mutanten wurden Expressionsanalysen und Kultivierungsoptimierungen im Schüttelkolbenexperiment durchgeführt. Vor der Übertragung des Prozesses in die Pilotanlage und Maßstabsvergrößerung in der Fermenterkaskade erfolgte zunächst eine Prozessoptimierung im Labormaßstab.Abb. 1: Vorgehensweise zur Herstellung eines rekombinanten P. pastoris-Stammes zur Herstellung einer Lipase mit Perhydrolaseaktivität (PER1) im großtechnischen Maßstab. Nach der genomischen Integration des Expressionskonstruktes (AOX1-Promoter - Sekretionssignal (α) - Codon-optimierte Lipasesequenz – AOX1-Terminator) in den P. pastoris-Stamm und der Selektion geeigneter Mutanten wurden Expressionsanalysen und Kultivierungsoptimierungen im Schüttelkolbenexperiment durchgeführt. Vor der Übertragung des Prozesses in die Pilotanlage und Maßstabsvergrößerung in der Fermenterkaskade erfolgte zunächst eine Prozessoptimierung im Labormaßstab.
  • Abb. 1: Vorgehensweise zur Herstellung eines rekombinanten P. pastoris-Stammes zur Herstellung einer Lipase mit Perhydrolaseaktivität (PER1) im großtechnischen Maßstab. Nach der genomischen Integration des Expressionskonstruktes (AOX1-Promoter - Sekretionssignal (α) - Codon-optimierte Lipasesequenz – AOX1-Terminator) in den P. pastoris-Stamm und der Selektion geeigneter Mutanten wurden Expressionsanalysen und Kultivierungsoptimierungen im Schüttelkolbenexperiment durchgeführt. Vor der Übertragung des Prozesses in die Pilotanlage und Maßstabsvergrößerung in der Fermenterkaskade erfolgte zunächst eine Prozessoptimierung im Labormaßstab.
  • Abb. 2: Pilotanlage zur Fermentation und Aufarbeitung am Fraunhofer CBP. (A) Fermenterkaskade mit Bioreaktoren von 10, 100, 1.000 und 10.000 L. (B) Stufenweise Hochskalierung des Fermentationsprozesses zur Herstellung einer rekombinanten Lipase mit Perhydrolaseaktivität in P. pastoris bis in den 1.000-L-Bioreaktor. Die Enzymproduktion wird durch Induktion mit Methanol (MeOH) eingeleitet. VK = Vorkultur, HK = Hauptkultur.
  • Abb. 3: (A) Vergleich der Lipaseaktivitäten im Kulturüberstand des rekombinanten P. pastoris- Stammes. Gezeigt sind die Kultivierung im Schüttelkolben, Optimierung der Expression im 10-LBioreaktor und Expression nach Maßstabsübertragung in den 1.000-L-Bioreaktor. (B) Anwendung der rekombinanten Lipase mit Perhydrolaseaktivität zur Herstellung von Epoxiden am Beispiel der Epoxidierung von Drachenkopföl.
  • Tab. 1: Beispiele für Lipid-modifizierende Enzyme und ihre Anwendung.

Bioprozesstechnik: Mit der Entdeckung neuartiger Enzyme und der Entwicklung neuer Verfahrenstechniken erweitert sich das Anwendungsspektrum von Enzymen in der Industrie und somit steigt auch ihr wirtschaftliches Potential. Vor allem in der chemischen Industrie steigt die Nachfrage. Durch den Rückgang fossiler Ressourcen sollen hier Enzyme zum effektiveren Aufschluss und zur effizienteren Nutzung nachwachsender Rohstoffe eingesetzt werden, um dadurch langfristig Erdöl-basierte Rohstoffe ersetzen zu können.

Neben Polysacchariden, Zucker oder Aromaten aus Holz und Stroh sind Pflanzenöle wichtige Ausgangsstoffe für die Industrie [1]. Nach Schätzungen der USDA beträgt die Weltproduktion von Pflanzenölen für 2014/15 mit einer Zunahme von 3,3 % im Vergleich zum Vorjahr ca. 175 Millionen Tonnen. Zu den wichtigsten Ölen zählen Palm- (36 %), Soja- (27 %), Raps- (15 %), und Sonneblumenöl (9 %) [2]. Aber auch seltenere Pflanzenöle wie zum Beispiel Krambeöl sind von zunehmendem Interesse, da ihre Verwendung keine Konkurrenz zum Lebensmittelsektor darstellt [3].

Ausgehend von diesen Pflanzenölen lassen sich durch chemische Modifikationen Synthesebausteine gewinnen, die sich in weiterführenden chemischen Verfahren zu biokompatiblen Kunststoffen, Additiven, Schmierstoffen, Weichmacher und Stabilisatoren verarbeiten lassen. Die Bereitstellung von Synthesebausteinen aus Pflanzenölen kann alternativ biotechnologisch durch den Einsatz von Lipid-modifizierenden Enzymen wie Phospholipasen oder Lipasen unter milderen, somit umweltfreundlicheren und selektiveren Reaktionsbedingungen erfolgen (Tabelle 1). Der Durchbruch von Enzymen als Biokatalysatoren in der chemischen Industrie wird allerdings durch die häufig zu hohen Kosten der Enzymproduktion behindert. Die Entwicklung von effizienten Expressionssystemen und Produktionsverfahren ist somit ein entscheidender Schritt, um Produktionskosten zu senken und die Wirtschaftlichkeit enzymbasierter Prozesse gewährleisten zu können.

Fermentative Herstellung Lipid-modifizierender Enzyme
Das Fraunhofer IGB befasst sich mit der Entwicklung effizienter, rekombinanter Expressionsverfahren zur großtechnischen Produktion industrieller Enzyme.

Ein zentrales Arbeitsziel war die Entwicklung einer Pilotanlage zur Enzymproduktion, die eine skalierbare Übertragbarkeit von im Labor entwickelten Bioprozessen bis in den 10.000 Liter-Maßstab ermöglicht.

Ein Schwerpunkt wurde auf die Entwicklung optimierter Produktionsstämme und Verfahrensprozesse zur Herstellung Lipid-modifizierender Enzyme, im Besonderen Lipasen mit Perhydrolaseaktivität gelegt, um diese zur Herstellung von Epoxiden als Synthesebausteine auf Basis von Pflanzenölen einzusetzen.

Lipasen mit Perhydrolaseaktivität zeigen im Gegensatz zu den klassischen Lipasen und Esterasen nur eine geringe Hydrolyseaktivität, dafür aber eine starke Perhydrolyseaktivität, durch die sie die Bildung von Persäure aus Carbonsäuren und Wasserstoffperoxid katalysieren können. Die gebildete Persäure oxidiert daraufhin ungesättigte Fettsäuren spontan zum Epoxid. Daher sind Perhydrolyse-aktive Enzyme von großem Interesse für die Herstellung von Triglyzerid-Epoxiden oder Epoxiden aus freien Fettsäuren oder korrespondierenden Estern der Pflanzenöle, die gegenwärtig über rein chemische Verfahren erfolgt [3].

Mehrere pilzliche Lipasen mit Perhydrolaseaktivität wurden identifiziert und eine rekombinant in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Die Regulation der Lipaseexpression erfolgte über den sehr starken Methanol-induzierbaren Promoter der Alkoholoxidase 1 (AOX1). Methanol ist ein preisgünstiges Induktionsmittel, erfordert aber aufgrund der Entflammbarkeit und Toxizität bestimmte Sicherheitsvorkehrungen, besonders bei der Fermentation mit hohen Arbeitsvolumina [4]. Aus diesem Grund wird P. pastoris, trotz der wesentlichen Vorteile dieses Expressionssystems für einen großtechnischen Einsatz wie z.B. die Hochzelldichtefermentation [5], vorwiegend nur im Labormaßstab (meist nur bis 5 L) zur Produktion von rekombinanten Enzymen genutzt. Eine Produktion im großtechnischen Maßstab ist dagegen aufgrund der geforderten Sicherheitsvorschriften beim Bau und Betrieb einer für Methanolinduktion ausgelegten Anlage erschwert. Aufgrund der wachsenden Bedeutung des Pichia-Expressionssystems wurde die Pilotanlage explizit auf die Verwendung von Methanol als Induktionsmittel ausgelegt (z.B. durch den Einbau von Methanolsonden, explosionsgeschützten Behältnissen zur Lagerung großer Mengen an Methanol, einer gesonderten Abluftanlage und einer speziellen Mess- und Regeleinrichtung).

Abbildung 1 illustriert schematisch die einzelnen Schritte von der Erzeugung und Selektion des rekombinanten P. pastoris-Stammes, über Expressionsversuche im Labormaßstab, bis zur Übertragung des Prozesses in den großtechnischen Maßstab. Zunächst erfolgte eine Optimierung des Fermentationsprozesses mit dem rekombinanten P. pastoris Stamm in einem 10-L-Bioreaktor bevor der Prozess in die Fermenterkaskade zur Maßstabsvergrößerung bis in den 1.000-L-Bioreaktor überführt wurde (Abb. 2). Dies erforderte zum Aufbau der nötigen Startbiomasse zusätzliche Vorkultivierungsschritte im 10- und schließlich im 100-L-Bioreaktor. Erst im 1.000-L-Bioreaktor wurde die Enzymproduktion durch Zugabe von Methanol induziert (Abb. 2 (B)). Wie Abbildung 3 (A) zeigt konnte der Prozess ohne Aktivitätsverluste vom 10- in den 1.000-L-Bioreaktor übertragen werden. Insgesamt konnten in dem 1.000-L-Bioreaktor ~229,1 U/L (155 kU insgesamt) Enzym hergestellt und somit eine 25-fach höhere Ausbeute als im Schüttelkolben erzielt werden. Des Weiteren konnte die Eignung der rekombinanten Lipase mit Perhydrolaseaktivität zur Herstellung von epoxidiertem Drachenkopföl gezeigt werden (Abb. 3 (B)).

Ausblick
Für die rekombinante Lipase mit Perhydrolaseaktivität soll in weiteren Experimenten die Immobilisierung auf geeigneten Trägermaterialen getestet werden. Als nächster Schritt wird das Enzym in einem größeren Maßstab zur Synthese von biobasierten Epoxiden aus pflanzlichen Ölen eingesetzt.

Danksagung
Diese Arbeit wurde von dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Fkz AZ 0315510), sowie durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft, BMEL, und der Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe, FNR (Fkz 22027407 und 22010112) finanziell gefördert.

Literatur
[1] Tiran C. et al.: OCL. 15:179 - 83 (2008)
[2] http://apps.fas.usda.gov/psdonline/psdHome.aspx
[3] Haitz F. et al.: GIT Labor Fachzeitschrift. p. 179-181 (2013)
[4] Macauley-Patrick S. et al.: Yeast. 22: 249-270 (2005)
[5] Cereghion J.L. and Cregg J.M.: FEMS Microbiol Rev. 24:45-66 (2000)

Autoren:
N. Helber1, B. Vater1, F. Haitz2,
S. Torkler3, K. Patzsch3 und S. Zibek1

1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB, Stuttgart

2Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik und Plasmatechnologie, Universität Stuttgart

3Fraunhofer-Zentrum für Chemisch-Biotechnologische Prozesse, Leuna

Kontakt
Dr. Katja Patzsch
Fraunhofer-Zentrum für
Chemisch-Biotechnologische Prozesse CBP, Leuna
katja.patzsch@cbp.fraunhofer.de
www.cbp.fraunhofer.de

Dr.-Ing. Susanne Zibek
Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB
susanne.zibek@igb.fraunhofer.de
www.igb.fraunhofer.de

Mehr Informationen zum Projekt Innozym finden Sie hier.

 

Kontaktieren

Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB
Nobelstr. 12
70569 Stuttgart
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Telefon: +49 711 9704 001
Telefax: +49 711 9704 200

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