Bioprozesstechnik: Online-Messung metabolischer Aktivitäten

Die Notwendigkeit der Charakterisierung von Materialien und Medienbestandteilen

  • Abb. 1: Ramos-System zur online Messung u.a. der Sauerstofftransferraten in acht parallelen geschüttelten Reaktorsystemen [1].Abb. 1: Ramos-System zur online Messung u.a. der Sauerstofftransferraten in acht parallelen geschüttelten Reaktorsystemen [1].
  • Abb. 1: Ramos-System zur online Messung u.a. der Sauerstofftransferraten in acht parallelen geschüttelten Reaktorsystemen [1].
  • Abb. 2: Biokompatibilität von Polymer-Werkstoffen in Bioreaktorsystemen: (A) Integriertes Membranmodul zur in situ Produktabtrennung; (B) Polymer-Werkstoffe zur Verwendung im Membranmodul, von links nach rechts: Polyetheretherketon (PEEK), Polytetrafluoroethylen (Teflon), Polypropylen (PP), Polyurethan (PUR), Polyamid 6.6 (Nylon), Polyamid 12 (PA); (C) Einfluss der verschiedenen Polymer-Werkstoffe aus Abbildung 2B und (D) der Polyamid-Konzentration auf die Atmungsaktivität von H. polymorpha [2].
  • Abb. 3: Kultivierung von E. coli K12 in LB Medium mit verschieden silberdotierten Membranbestandteilen. Einfluss der verschiedenen Dotierungen auf die Atmungsaktivität von E. coli K12 [3].
  • Abb. 4: Kultivierung von rekombinanten E. coli in TB-Medium mit verschiedenen Hefeextrakten unter induzierenden Bedingungen. Sauerstofftransferrate von E. coli während der Expression eines rekombinanten Proteins in induzierendem TB-Medium unter Zusatz von Hefeextrakten verschiedener Hersteller (A) und von Hefeextrakten eines Herstellers in verschiedenen Chargen (B). Die volumetrische Enzymaktivität (C) wurde in jedem Medium nach einer Kultivierungszeit von 14 h gemessen.

Bioprozesstechnik: Beeinflussen unterschiedliche Werk- und Einsatzstoffe einen biotechnologischen (Produktions-)Prozess und das Wachstum von Mikroorganismen, auch wenn bei oberflächlicher Betrachtung kaum ein Unterschied besteht? Diese Frage kommt in zunehmendem Maße in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie auf, wie z. B. bei der Entwicklung neuer Einwegbioreaktoren.

In diesen Systemen kommen Mikroorganismen mit Polymermaterialien in Berührung, die gänzlich andere Eigenschaften haben als klassischer Edelstahl oder Glas. Ein Test dieser Polymermaterialien auf ihre Biokompatibilität ist daher essentiell, um einen Einfluss auf die verwendeten Mikroorganismen auszuschließen. Darüber hinaus werden vermehrt funktionalisierte Materialien mit den unterschiedlichsten Anwendungsgebieten angeboten. Ein Beispiel sind Produkte, die das Oberflächenwachstum von Mikroorganismen gezielt verhindern sollen und somit antibakteriell einsetzbar sind. Dieser Effekt muss jedoch qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden.

Welchen Einfluss haben komplexe Medienbestandteile auf die Reproduzierbarkeit eines mikrobiellen Systems? Jeder Anwender kann z. B. den Medienzusatz Hefeextrakt von einer Vielzahl weltweiter Hersteller erwerben. Allerdings können bereits kleine Unterschiede in der Herstellung zu erheblichen Unterschieden im Hefeextrakt und den damit durchgeführten Experimenten führen. Bei einem Wechsel des Herstellers oder auch nur der Charge eines Komplexbestandteils, muss daher die Reproduzierbarkeit eines Forschungsergebnisses bzw. die Sicherstellung der Produktqualität untersucht werden. Insbesondere bei Prozessen, die nach GMP-Richtlinien ablaufen, sollte der Einfluss jedes Komplexmediumbestandteils charakterisiert werden.

Eine Möglichkeit die einzelnen Fragen zu untersuchen, die entsprechenden Unterschiede sichtbar zu machen und verschiedene Materialien zu qualifizieren, stellt der Einsatz der Ramos (Respiration Activity Monitoring System) -Technologie dar (Abb. 1). Mit dieser Anlage wird u. a.

die Sauerstofftransferrate (Oxygen Transfer Rate - OTR) von Mikroorganismen bestimmt, so dass exakte Aussagen über Art und Umfang der metabolischen Aktivität gemacht werden können [1].

Bio(in)kompatibilität
Durch die zunehmende Interdisziplinarität von Wissenschaft und Technik werden immer mehr Reaktorsysteme entwickelt, in denen vollkommen neue Materialien zum Einsatz kommen. Ein Beispiel ist die Integration eines Membranmoduls in ein Reaktorsystem, so dass bereits im laufenden Prozess Produkte, z. B. Antikörper, abgetrennt werden können (Abb. 2A). Eine entscheidende Herausforderung ist dabei herauszufinden, ob diese Materialien biologisch kompatibel sind und wie dies am besten nachgewiesen werden kann. Um die Biokompatibilität der Membranen und des Moduls zu beurteilen, wurden Experimente in der Ramos-Anlage durchgeführt. Dafür wurde Membran(modul)material (Abb. 2B) und Medium gemischt und anschließend zusammen autoklaviert. Durch Druck und Temperatur während der Sterilisation besteht bei vielen Materialien die Gefahr, dass sich schädliche Stoffe aus ihnen herauslösen (Leaching). Im Fall von Membranmaterialien aus Polymeren könnten durch dieses Leaching z. B. Weichmacher ins Medium abgegeben werden. Aus diesem Grund wurden verschiedene Polymere ausgewählt und deren Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Hansenula polymorpha untersucht.

Entscheidend ist der Verlauf der Sauerstofftransferrate während der Kultivierung im Vergleich zur Referenzkultivierung ohne zugesetztes Polymer [2]. In Abbildung 2C wird ersichtlich, dass die meisten Polymer-Werkstoffe grundsätzlich biokompatibel sind, da die Atmungsaktivität der H. polymorpha-Kultur im Vergleich zur Referenz bei der eingesetzten Menge an Polymermaterial nicht beeinflusst wird. Die einzigen Ausnahmen bilden Nylon und Polyamid 12, welche die Atmung und damit das Wachstum stark hemmen bzw. vollständig inhibieren.

Ob ein Stoff tatsächlich biokompatibel ist bzw. bis zu welcher Grenze, hängt stets von dessen Konzentration ab. Zur Untersuchung der kritischen Konzentration der in Frage kommenden Stoffe wurden weitere Experimente durchgeführt. In Abbildung 2D ist dies beispielhaft für verschiedene Polyamid-Konzentrationen dargestellt. Die Sauerstofftransferrate und damit die metabolische Aktivität wird bereits ab 4 g l-1 Polyamid negativ beeinflusst, bei ­ 40 g l-1 ­ist bereits keinerlei Wachstum mehr möglich. Vergleichbare Experimente können auch mit mehrfach autoklavierten Polymer-Werkstoffen durchgeführt werden, um zu untersuchen, ob der Effekt des Leachings von inkompatiblen Stoffen mit den Autoklavierzyklen nachlässt.

Bei den meisten Prozessen, die keine biologische Konversion von Stoffen beinhalten, ist das Wachstum von Mikroorganismen in den Anlagen oder auf deren Oberflächen absolut unerwünscht. Daher wurden verschiedene Ideen entwickelt, wie die Ausbildung von Biofilmen auf Oberflächen erschwert oder vollständig unterbunden werden können. Ob und in welchem Umfang das Wachstum tatsächlich verhindert wird, kann ebenfalls mit der Technologie ermittelt werden. Als Beispiel ist die Wirksamkeit verschiedener silberdotierten Membranoberflächen in Abbildung 3 dargestellt. Alle dotierten Membranen verzögern im Vergleich zur undotierten Referenz-Membran das Wachstum [3].

Mit der Anlage steht damit eine Technologie zur Verfügung, mit der neue Materialien schnell hinsichtlich ihrer Biokompatibilität bzw. ihrer antibakteriellen Wirkung (und deren Grenzen) untersucht werden können.

Einfluss komplexer Medienbestandteile von verschiedenen Herstellern
Komplexe Medienbestandteile wie z.B. Hefeextrakt werden in der Forschung und in der Industrie gerne aufgrund der universellen Anwendbarkeit eingesetzt. Ein signifikanter Nachteil ist allerdings die vergleichsweise undefinierte Zusammensetzung. Variationen in der Zusammensetzung der Hefeextrakte verschiedener Hersteller und sogar verschiedener Chargen eines Herstellers können daher nicht ausgeschlossen werden. Zum Test verschiedener Hefeextrakte wurden die in Abbildung 4 dargestellten Experimente durchgeführt, bei denen nur der jeweilige Hefeextrakt variiert wurde. Abbildung 4A zeigt den Einfluss von Hefeextrakten vier verschiedener Hersteller auf E. coli-Kultivierungen. Alle vier Sauerstofftransferraten, die mehrfach reproduziert wurden, unterscheiden sich signifikant voneinander, wobei Hefeextrakt 2-1 besonders stark abweicht. Noch gravierender sind allerdings die Unterschiede in der Aktivität des gebildeten rekombinanten Enzyms (Abb. 4C), die von 0,1 bis 0,35 U ml-1 reicht. Die Reproduktion eines Versuches kann bei der Verwendung von Hefeextrakten verschiedener Hersteller daher äußerst schwierig oder sogar unmöglich sein. Beim Vergleich der Kultivierungen mit verschiedenen Hefeextrakt-Chargen des gleichen Herstellers (Abb. 4B) sind ebenfalls unterschiedliche Verläufe in der Sauerstofftransferrate zu beobachten. Der Vergleich der Aktivität des gebildeten rekombinanten Enzyms zeigt auch hier gravierende Unterschiede (Abb. 4C). Alle in Abbildung 4 dargestellten Experimente wurden mittels Doppelbestimmung reproduziert.

Scheinbar gleiche Komplexmedien können demnach aufgrund kleiner Variationen in ihrer Zusammensetzung erheblichen Einfluss auf das Wachstum und die Produktbildung von Mikroorganismen haben. Für jeden (Produktions-)prozess, insbesondere für Prozesse unter GMP-Bedingungen, ist daher eine ständige Überprüfung des Einflusses komplexer Medienbestandteile unumgänglich. Mit der hier gezeigten Technologie steht damit eine online-Messmethode zur Verfügung, mit der mögliche Einflussfaktoren auf die Reproduzierbarkeit von Versuchsergebnissen schnell und einfach in mehrfacher Ausführung untersucht und identifiziert werden können.

Referenzen
[1] Anderlei T. et al.: Biochem Eng J 17:187-194 (2004).
[2] Meier K. et al.: Polymer Testing 32:1064-1071 (2013).
[3] Kochan J. et al.: Water Research 46(16):5401-5409 (2012).

 

Weiteren Beitrag zum Thema: www.git-labor.de/Bioprozessanalyse
Mehr Informationen: www.git-labor.de/bioprozesstechnik

 

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