Bodenbakterien als erfolgreiche Antibiotikaproduzenten

Von der Bodenprobe zum neuen Naturstoff

  • Abb. 1: Schwärme und Fruchtkörper von Myxobakterien auf Agarplatten, © Diana TelkemeyerAbb. 1: Schwärme und Fruchtkörper von Myxobakterien auf Agarplatten, © Diana Telkemeyer
  • Abb. 1: Schwärme und Fruchtkörper von Myxobakterien auf Agarplatten, © Diana Telkemeyer
  • Abb. 2: a) Wasseragarplatte mit räuberischen Myxobakterium (Myxococcus) auf Futterorganismenkreuz. In der Vergrößerung rechts sind gelbe Fruchtkörper zu sehen. b) Bodenproben auf Zellulosefilter mit Zellulose-zersetzendem Myxobakterium (orange). In der Vergrößerung rechts: Zellulose-Zersetzer auf Filterpapier in Reinkultur (Sorangium cellulosum). Oben mittig im Bild Fruchtkörperbildung c) Myxobakterien-Reinkulturen in Flüssigmedium d) Serienverdünnungstest mit Rohextrakten. Die stärkste Hemmung liegt in Reihe 4 vor. e) Peak-Aktivitäts-Korrelation mit der Fraktionierungsplatte. f) Fermenter zur Kultivierung größerer Volumina g) Präparative Aufarbeitung eines Fermenter im chemischen Laboratorium. h) Sandaracinus amylolyticus auf Agarplatte und i) die Struktur des von diesem Stamm produzierten Naturstoffs Indiacen A [5].

Durch die zunehmende Resistenzentwicklung vieler pathogener Keime gegenüber den gängigen Antibiotikaklassen, steigt der Bedarf an neuen Antibiotika stetig. Hierbei dient Erdboden, mit seiner unermeßlichen Anzahl und Diversität an Bodenbakterien, als unerschöpfliche Quelle für neue Naturstoffproduzenten. Die bodenbesiedelnde Myxo- und Aktinobakterien beispielsweise sind als hervorragende Naturstoff-Produzenten seit Jahrzehnten bekannt. Zum einen  konkurrieren sie im Boden mit anderen Mikroorganismen um Nährstoffe und verschaffen sich durch die Produktion von Antibiotika vermutlich einen Standortvorteil. Zum anderen dienen die Sekundärmetabolite der Kommunikation zwischen den Mikroben. Die Isolierung solcher Bakterien und das Screening gegen verschiedene mikrobielle Testorganismen haben in der Vergangenheit zur Beschreibung Tausender neuer Naturstoffe, oft mit biologischer Aktivität, geführt.

Die Geschichte der Antibiotika

Bevor es Antibiotika und Impfstoffe gab, glichen Infektionen mit Erregern von Pocken, Syphilis, Tuberkulose, Lepra, Pest, Cholera oder Typhus häufig einem Todesurteil. Wer nicht verstarb war in vielen Fällen durch Mißbildungen gebrandmarkt, wurde isoliert und/oder war fortan körperlich stark eingeschränkt (Lepra). Die Pest raffte im 14. Jahrhundert mehr als 25 Millionen Menschen dahin. Solche Pandemien waren keine Seltenheit und mussten als gottgegeben hingenommen werden.

Schon seit Anbeginn der Menschheitsgeschichte wurde die Natur als Apotheke benutzt, auch wenn man lange Zeit nichts von den Zusammenhängen zwischen Erregern und Wirkstoffen wusste. Als ein chemotherapeutischer Ansatz vom 17. Jahrhundert aus Südamerika sei nur folgender Bericht genannt: Eingeborene (Quechua) behandelten Fieberschübe von Malariakranken erfolgreich mit Extrakten des Chinarindenbaumes. Die aktive Substanz, das Alkaloid Chinin, war ihnen zum damaligen Zeitpunkt natürlich nicht bekannt.

Mikrobiologie und Wirkstoffforschung

Einen ersten Schritt in Richtung Mikrobiologie machte Antoni van Leeuwenhoek (1632 - 1723), welcher mit Hilfe eines selbstgebauten Mikroskops Mikroorganismen, Spermien und Pflanzenquerschnitte detailliert beobachtete und beschrieb.

Louis Pasteur (1822 - 1895) gelang es Bakterien im Labor zu isolieren und zu kultivieren. Das nach ihm benannte Verfahren der Pasteurisation ermöglichte die längere Lagerung von überwiegend flüssigen Nahrungsmitteln. Robert Koch (1843 - 1910) identifizierte unter anderem die Erreger von Tuberkulose, Cholera und Milzbrand (Anthrax) und konnte sie einem Krankheitsbild zuordnen. Mit der organischen Arsenverbindung Salvarsan gelang Paul Ehrlich (1854 – 1915) und Kollegen Anfang des letzten Jahrhunderts ein Meilenstein in der Arzneimittelforschung. Erstmals stand eine gezielt antimikrobiell wirksame Substanz gegen eine unheilvolle Infektionskrankheit, in diesem Fall Syphilis, zur Verfügung. Die Entdeckung der antibakteriellen Aktivität von Prontosil, einem Azofarbstoff aus der Gruppe der synthetischen Sulfonamide, brachte Gerhard Domagk (1895 -1964), wie auch vorher schon Koch und Ehrlich, den Nobelpreis für Physiologie/Medizin ein. Die Entdeckung des ersten von einem Mikroorganismus produzierten, antibakteriellen Wirkstoffes, dem Penicillin, gelang durch Zufall: Alexander Fleming (1881 – 1955) vergaß eine Bakterienkulturplatte, welche durch Penicillium notatum kontaminiert wurde. Ein Hemmhof um den Pilz zeigte an, dass dieser offensichtlich eine antibiotische Substanz produzierte, welche die Bakterien im Wachstum hemmte. Diese zu den β-Lactam-Antibiotika gehörende Substanz wurde jedoch erst Jahre später in großem Maßstab produziert. Ab Ende des Zweiten Weltkrieges stand Penicillin dann sowohl den amerikanischen Soldaten als auch der Zivilbevölkerung zur Verfügung. Nun kannte die Suche nach neuen, antibakteriellen Wirkstoffen aus Pflanzen oder Mikroorganismen keine Grenzen mehr. In Goldgräberstimmung wurden bis Mitte der 60er Jahre des letzten Jahrhunderts viele verschiedene mikrobiell aktive Substanzklassen entdeckt. Die Anpassung der Zielorganismen in Form von Resistenzbildungen folgte jedoch in den meisten Fällen ernüchternd schnell.

Resistenz

Infektionen mit multiresistenten Erregern wie Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE), Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus – Keimen (MRSA) oder extended-spectrum-β-lactamase-Bildnern (ESBL) nehmen stetig zu. Ursachen hierfür sind die oft unkritische Verschreibung von Antibiotika sowie der exzessive, teils prophylaktische Einsatz in der Tiermast. Insbesondere nosokomiale Infektionen (im Krankenhaus erworben) stellen eine stetig wachsende Gefahr für Patienten dar. Die häufigsten Erreger nosokomialer Infektionen werden unter dem Begriff ESKAPE-Panel zusammengefaßt: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa sowie verschiedene Enterobacter – Arten stehen als Zielorganismen im Mittelpunkt des Interesses der heutigen Antibiotikaforschung [1]. Bedingt durch die zunehmende Globalisierung spielen aber auch viele bereits besiegt geglaubte Infektionen wie z. B. die Tuberkulose wieder eine wichtige Rolle bei der Suche nach neuen Wirkstoffen. Auch die momentan 17 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ausgewiesenen neglected tropical diseases, wie beispielsweise Afrikanische Schlafkrankheit, Leishmaniose, Buruli Ulkus, Flussblindheit oder Dengue-Fieber, stellen insbesondere für die ärmeren Teile der Weltbevölkerung eine stetige Bedrohung dar.

Myxobakterien als Ausgangsmaterial

Am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig (HZI) werden seit über 30 Jahren Myxobakterien aus Bodenproben isoliert und hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität gegen verschiedene Bakterien, Pilze und Zelllinien getestet. Seit einigen Jahren werden zusätzlich Pilze und Aktinobakterien isoliert und auf Antibiotikaproduktion hin untersucht. Speziell aus Aktinobakterien und Bodenpilzen wurden jedoch in den letzten hundert Jahren bereits zahlreiche bioaktive Naturstoffe beschrieben, so dass die Wiederfindungsrate bekannter Substanzen hier relativ hoch ist. Durch den Einsatz ungewöhnlicher und seltener Mikroorganismen werden am HZI insbesondere aus Myxobakterien, jedoch auch aus Aktinobakterien und Pilzen, stetig neue, oft bioaktive Naturstoffe isoliert und publiziert [2].

Myxobakterien sind Gram-negative, aerobe Boden- und Holzbewohner und können sich auf feuchten Oberflächen gleitend fortbewegen. Die meisten der über 50 beschriebenen Myxobakterienarten leben räuberisch, indem sie andere Bodenorganismen durch Hilfe ausgeschiedener Enzyme zersetzen und sich deren Nährstoffe einverleiben. Wenige Arten können Zellulose degradieren. Alle bekannten Myxobakterien pflegen einen faszinierenden „sozialen“ Lebensstil. Man trifft sie in Schwärmen an, in denen sich die vegetativen Zellen unter geeigneten Nährstoffbedingungen nach Bakterienart teilen. Unter Mangelbedingungen aggregieren die Zellen einer Art und bilden artspezifische „Fruchtkörper“. Diese können von primitiver Bläschenform bis hin zu aufwendig verzweigten Bäumchen verschiedenste, oft farbenfrohe Formen annehmen (siehe Abb. 1). Innerhalb der Fruchtkörper wandelt sich ein Teil der vegetativen Zellen zu so genannten Myxosporen um. Diese trocken-resistenten Dauerformen können unter geeigneten Bedingungen auch nach vielen Jahren wieder auskeimen. Für die Naturstoffforschung sind Myxobakterien insbesondere deshalb interessant, weil sie im Vergleich zu anderen Bakterien über sehr große Genome verfügen (13 Megabasenpaare bei Sorangium cellulosum [3]; zum Vergleich: 4.6 Mbp bei E. coli). Auf diesen können riesige Multienzym-Assemblierungslinien liegen, welche aus Polyketid Synthasen (PKS) und nicht-ribosomalen Polypeptidsynthetasen (NRPS) bestehen. An diesen Komplexen wird die Mehrzahl der myxobakteriellen Sekundärmetabolite wie Polyketide, nicht-ribosomale Polypeptide oder Hybride dieser beiden Substanzklassen, synthetisiert.

Isolierung von Myxobakterien

Um Myxobakterien aus Umweltproben zu isolieren, werden standardmäßig zwei Kultivierungsansätze gefahren: für räuberische Myxobakterienarten wird etwas Umweltprobe (Boden, Totholz, Kompost, etc.) auf Wasseragarplatten ausgebracht und lebende Escherichia coli Bakterien als Futterorganismen angeboten. In der Probe befindliche Myxobakterien schwärmen nach einigen Tagen über die Futterorganismen, lysieren diese und bilden, oft makroskopisch sichtbare, Fruchtkörper. Für die Zellulose zersetzenden Gattungen wird, ebenfalls auf Agar, Zellulose-Filterpapier angeboten [4]. Anwesende Zelluloseabbauer beginnen den Filter nach ca. 2 Wochen zu zersetzen und bilden ebenfalls oft farbige Fruchtkörper. Die Fruchtkörper oder ein Teil des Schwarmrandes können dann auf eine neue Agarplatte mit Futterorganismen übertragen werden. Aufgrund ihres regen Schwarmverhaltens hängen die Myxobakterien andere, meist nicht oder langsamer schwärmende Bodenbakterien ab. Durch mehrmaliges Überimpfen erhält man Reinkulturen. Neu isolierte Bakterien werden dann in verschiedenen Flüssig-Vollmedien, welche sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen im Laufe der Jahre für die Naturstoffproduktion bei Myxobakterien als sehr geeignet erwiesen haben, kultiviert.

Extraktion der Metabolite

Zu den Medien wird 2% XAD-Adsorberharz hinzugegeben, an welchem die ausgeschleusten Sekundärmetabolite binden. Somit wird einerseits eine mögliche Feedback-Hemmung des Produzenten verhindert. Andererseits werden die gebildeten Moleküle vor einer möglichen Degradation durch den Produzenten geschützt.

Die meisten von Myxobakterien produzierten Naturstoffe liegen im mittleren Polaritätsbereich, so dass die alleinige Aufarbeitung des Harzes mit Aceton ausreicht. Für sehr unpolare Substanzen, die an den Zellwänden haften können, müssen zusätzlich zum Harz auch die Zellen aufgearbeitet sowie unpolare Lösemittel gewählt werden. Nach Extraktion der Metabolite wird die Aktivität des so genannten Rohextraktes in einem Serienverdünnungstest gegen verschiedene Mikroorganismen in einer 96 Lochplatte getestet. Tritt hier eine Hemmung auf, wird der Rohextrakt mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Hilfe eines Fraktionssammlers in eben solche Platte fraktioniert. Bei der HPLC handelt es sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem der Extrakt mit einem Laufmittel (mobile Phase), welches einen abnehmenden Polaritätsgradienten aufweist, über eine Trennsäule (stationäre Phase) geführt wird. Die im Rohextrakt vorhandenen Substanzen wechselwirken unterschiedlich stark mit der Säule. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Substanzen zu verschiedenen Retentionszeiten am Ende der Trennsäule, wo sie mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können. Bei der Fraktionierung wird der Durchfluß alle 30 Sekunden in einem neuen Loch gesammelt. Die Platte wird anschließend mit dem vorher gehemmten Testorganismus beimpft und inkubiert. Eine mögliche Hemmung in einem oder mehreren Löchern kann bestimmten Retentionszeiten und den dazugehörigen UV-Chromatogrammen, welche für jede Substanz spezifisch sind, zugeordnet werden. Vermißt man die Probe jetzt noch in einer HPLC mit angeschlossenem Massendetektor, kann man der Substanz zusätzlich zur Aktivität, Retentionszeit und dem UV-Chromatogramm auch eine Molekularmasse zuordnen. Anhand dieser Informationen können durch Abgleich mit internen und öffentlichen Datenbanken sowohl bekannte als auch unbekannte Substanzen als solche identifiziert werden.

Trotz hoher Wiederfindungsrate werden auf diesem Wege regelmäßig neue Naturstoffe entdeckt. Nur selten werden diese von dem Produzenten jedoch in zufriedenstellender Menge produziert. Nun ist das Geschick der Mikrobiologen gefragt, die durch Testung verschiedener biotischer und abiotischer Faktoren versuchen eine Produktionssteigerung zu erreichen. Bei ausreichender Produktion im Labormaßstab (100 ml) wird die Stabilität der Produktion in höheren Volumina (bis zu 300 Litern) schrittweise getestet. Nicht selten ist die Produktion im Fermentermaßstab, vermutlich aufgrund abweichender Sauerstoffkonzentration, welche im Laborkolben nur schwer geregelt werden kann, nicht erfolgreich. Dann kann eine Produktion ausschließlich im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt werden. An eine erfolgreiche Fermentation, ob in der Schüttelkultur oder im Fermenter, schließen sich die Isolierung und Strukturaufklärung (HRMS, NMR; Abb. 2) der neuen, biologisch aktiven, Verbindungen an.

Prüfung der Wirksamkeit

Liegt eine neue Substanz vor, wird die minimale Hemmkonzentration der Reinsubstanz gegen ein breiteres Panel mit zusätzlichen infektionsrelevanten Testorganismen getestet. Von großem Interesse bei neuen Substanzen ist auch deren Wirkmechanismus auf die Zielorganismen sowie die Information über mögliche Kreuzresistenzen zu bereits bekannten Antibiotika. Mögliche Angriffsorte eines Antibiotikums sind die Hemmung der Zellwandsynthese, der Proteinsynthese, der Folsäuresynthese oder der DNA-Replikation. Interessante und erfolgversprechende Strukturen müssen zunächst patentiert werden, um einen Substanzschutz zu sichern. Häufig jedoch erweist sich eine Substanz als zu toxisch für eine weitere Bearbeitung. Ausnahmslos alle neu isolierten Reinsubstanzen werden vom HZI an verschiedene Kooperationspartner mit unterschiedlichsten Testsystemen verteilt. Nicht selten erweist sich dort eine im hausinternen Standardpanel Hemmtest unauffällige Substanz in anderen Testsystemen als aktiv und wird somit bearbeitungswürdig.

Quo Vadis

Obwohl immer wieder totgesagt, hat das Naturstoffscreening mit Substanzen aus Mikroorganismen in all den Jahren nicht an Bedeutung verloren. Im Gegenteil: Durch die steigende Resistenzentwicklung vieler krankenhausrelevanter Keime, aber auch durch die zunehmende Rolle der „neglected diseases“ in den vorwiegend ärmeren Teilen der Weltbevölkerung, hat die Suche nach neuen Antiinfektiva sogar wieder zugenommen. Auch die diesjährige Physiologie/Medizin-Nobelpreisvergabe an drei Parasitenforscher bestätigt diesen Trend. Der Ire William C. Campbell und der Japaner Satoshi Ōmura wurden für die Entdeckung des Antifadenwurmmittels Ivermectin, einem Abkömmling des aus dem Aktinobakterium Streptomyces avermitilis isolierten Avermectins, geehrt. Die Chinesin Youyou Tu bekam diese höchste Auszeichnung für die Entdeckung des Antimalariamittels Artemisinin, welches vom Einjährigen Beifuß (Artemisia annua) produziert wird. Des Weiteren hat die Sequenzierung naturstoffproduzierender Bakterien aus den Gruppen der Aktino- und Myxobakterien gezeigt, dass wir noch weit davon entfernt sind deren Potential vollständig auszuschöpfen. In vielen Genomen werden Gencluster für Naturstoffe in silico entdeckt, welche die Anzahl der tatsächlich in Standardkultivierungsexperimenten produzierten und nachgewiesenen Substanzen um ein Vielfaches übertreffen. Eines unserer Ziele ist es diese „schlafenden“ Gene mit verschiedenen Kultivierungsansätzen, welche den tatsächlichen Umweltbedingungen des Bakteriums möglichst nahe kommen, zu wecken. Auch verhindert die Größe und Komplexität der Genome neu isolierter Stämme bisher oft eine vollständige Annotation bzw. Interpretation der Sequenzen. Der klassische Screening-Weg wird also auch für die nächsten Jahre ein wichtiges Standbein in der Findung neuer, bioaktiver Naturstoffe sein.

Autoren
PD Dr. Joachim Wink, Dr. Kathrin I. Mohr

Zugehörigkeit
Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI)
Braunschweig, Deutschland

Kontaktieren

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH
Inhoffenstr. 7
38124 Braunschweig
Deutschland
Telefon: +49 531 61 81 0
Telefax: +49 531 61 81 26 55

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