Chemische Primerverlängerung: Technologie zur Sequenzabfrage und Potentiell Präbiotischer Prozess

  • Abb. 1: Primerverlängerung a) bei der Transkription in der Zelle und b) bei der chemischen Primerverlängerung mit aktiviertem Ribonucleotid und RNA-Templat.Abb. 1: Primerverlängerung a) bei der Transkription in der Zelle und b) bei der chemischen Primerverlängerung mit aktiviertem Ribonucleotid und RNA-Templat.
  • Abb. 1: Primerverlängerung a) bei der Transkription in der Zelle und b) bei der chemischen Primerverlängerung mit aktiviertem Ribonucleotid und RNA-Templat.
  • Abb. 2: Chemische Primerverlängerung beim RNA-System. a) Inhibierung der Primerverlängerungsreaktion durch hydrolysiertes, freies Nucleotid; b) Effiziente schrittweise Verlängerung eines RNA-Primers auf einem immobilisierten RNATemplat bei regelmäßiger Erneuerung des Überstandes mit aktivem Monomer. Der obere Teil zeigt die Sequenzen, einschließlich kurzer RNA-Microhelper- Stränge (grün), und der untere Teil das MALDI-ToFSpektrum des vierfach verlängerten Primers.
  • Abb. 3: a) Schema des linearen Amplifikationszyklus‘ mittels chemischer Primerverlängerung. b) Vorgeschlagener Mechanismus der chemischen Primerverlängerung mit aminoterminalem DNA-Primer auf einem RNA-Templat. c) Sequenz des Amplifikationssystems und repräsentatives MALDI-TOF-Massenspektrum nach dem 8. Zyklus. d) Akkumulierte Menge an verlängertem Primer mit steigender Anzahl Amplifikationszyklen (HEPBS-Puffer pH 8.9, 5 mM aktiviertes Nucleotid, 100 mM Pyridin).
  • v.l.n.r.: Dipl. chem. Heike Vogel, Dr. Christopher Deck, Prof. Clemens Richert, Dipl. chem. Mario Jauker, Universität Stuttgart

Die Polymerase-katalysierte, templatgesteuerte Verlängerung eines Primers um einzelne Nucleotide liegt der Replikation, der Transkription sowie Prozessen wie PCR und Sequenzierung zu Grunde. In Erweiterung klassischer Arbeiten zur präbiotischen Chemie konnte jetzt gezeigt werden, dass bei RNA Primerverlängerungen für alle vier Kernbasen auch enzymfrei effizient ablaufen können. Reaktionen mit aminoterminaler DNA laufen noch schneller ab und eröffnen Perspektiven für RNA-Nachweis, Genotypisierung, Ligation und Sequenzierung.

Die Weitergabe von genetischer Information erfolgt in der Natur durch die templatgesteuerte Synthese eines Gegenstrangs. Dabei wirkt Watson- Crick-Basenpaarung als das sequenzgebende Prinzip und die Freisetzung von Pyrophosphat aus einem Triphosphat-Monomer als die chemische Triebkraft. Die Reaktion von Triphosphaten erfolgt nur im aktiven Zentrum von Polymerasen mit messbarer Geschwindigkeit (Abb. 1). Das aktive Zentrum des Enzyms beschränkt jedoch die Breite an Substratstrukturen.

Es stellt sich deshalb die Frage, ob die templatgesteuerte Primerverlängerung nicht auch enzymfrei, d.h. rein chemisch, induziert werden kann. Dieser Fragestellung hatte sich zunächst das Arbeitsgebiet der präbiotischen Chemie angenommen, das mögliche molekulare Pfade zur Entstehung des Lebens auf der Erde untersucht [1]. Dabei ging es darum ein interessantes ‚Henne-Ei-Problem‘ der Präbiotik zu klären: Wie konnte die Weitergabe genetischer Information in den ersten Zellen ablaufen, wenn die Polymerase in einem Gen kodiert sein musste, dieses Gen aber nur mit Hilfe von einer Polymerase abgelesen werden konnte? Eines von beiden (Gen oder Polymerase) muss zuerst da gewesen sein. Wenn Nucleinsäuren sich jedoch selbst ablesen konnten, ging es vielleicht zunächst ohne Enzym.

RNA-Systeme

Das traditionell interessanteste Substrat für die chemische Primerverlängerung ist RNA, denn RNA ist reaktiver als DNA und war vermutlich die evolutionär frühere Nucleinsäure (Theorie von der RNA-Welt). Die enzymfreie Verlängerung von RNA-Primern auf RNA-Templatsträngen ist jedoch nur für Cytosin als Templatbase und Guanosinmonophosphat als Monomerbaustein effizient.

Reaktionen, die von anderen Basenpaaren induziert werden, sind ineffizient und kommen meist nach der initialen Reaktionsphase zum Erliegen [2].

Dies hat zu entmutigenden Prognosen für die Realisierbarkeit von RNA-basierten selbstreplizierenden molekularen Systemen geführt. Kürzlich gelang es uns nun nachzuweisen, dass die unvollständigen Reaktionen, die bei chemischen Primerverlängerungen mit RNA-Primern beobachtet werden, auf einen simplen Effekt zurück zu führen sind: Das Hydrolyseprodukt der Monomerbausteine, das im Verlaufe des Assays unweigerlich entsteht, wirkt als Inhibitor (Abb. 2a). Es blockiert vermutlich durch Basenpaarung die Reaktionsstelle.

Da die Hydrolyse nicht vollständig unterbunden werden kann, ergeben sich deshalb zwei Möglichkeiten für effiziente chemische Primerverlängerungsreaktionen: Immobilisierung von Templat und Primer mit periodischem Austausch des Überstandes oder kontinuierliche Regenerierung des Hydrolyseproduktes zum aktiven Monomer durch in situ-Reaktivierung.

Die erstgenannte Möglichkeit des periodischen Ersetzens der Reaktionslösung mit teilhydrolysiertem Monomer wurde in der kürzlich von uns veröffentlichten Studie realisiert [3]. Dazu wurden RNA-Templatsequenzen durch Hybridisierung an eine Oberfläche gebunden und täglich mit frischer Reaktionslösung versorgt. Unter diesen Bedingungen war nach drei bis vier Wochen Gesamt-Reaktionszeit ein nahezu quantitativer Einbau von vier Nucleotiden (U, G, A und C) zu beobachten (Abb. 2b). Die Reaktionen waren besonders erfolgreich, wenn die Temperatur abgesenkt wurde, um den Templateffekt zu verstärken und wenn kurze RNA-Stränge zugesetzt wurden, die unmittelbar neben dem jeweiligen Monomer binden können.

Diese verstärken den Templateffekt zusätzlich, sind aber durchaus nicht in allen Fällen für eine vollständige Umsetzung nötig. Schließlich wurden auch erste Ergebnisse zur Sequenzselektivität der enzymfreien Primerverlängerung im RNA-System erhalten [3], die darauf hindeuten, dass wie bei Analoga [4] korrekt verlängerte Sequenzen schneller verlängert werden als terminal fehlgepaarte Sequenzen.

Auch die zweite theoretische Möglichkeit die Inhibierung zu umgehen, die in situ-Reaktivierung der Monomere, die hydrolysiert worden sind, wird gegenwärtig im RNA-System untersucht. Hier ist eine Immobilisierung nicht notwendig, da Monomere und der Templat/ Primer-Komplex nicht periodisch getrennt werden müssen. Von modifizierten DNA-Strängen ist bekannt, dass eine chemische Primerverlängerung mit in situ-Reaktivierung bereits bei sehr niedrigen Nucleotidkonzentrationen erfolgreich abläuft [5].

Primerverlängerung an aminoterminaler DNA

Varianten der chemischen Primerverlängerungsreaktion, die mit aminoterminalen Primern ablaufen, sind unkompliziert, weil Aminogruppen dem Terminus des Primers hohe Reaktivität verleihen [6]. Wenn dann noch durch Änderungen in der Struktur der Kernbasen die Basenpaarung verstärkt wird, wie dies vor allem von der Arbeitsgruppe des Nobelpreisträgers Jack Szostak von der Harvard University vorgeschlagen wird [7], kann innerhalb von Stunden eine Mehrfachverlängerung induziert werden.

Unsere Arbeiten mit 3‘-aminoterminalen Primern haben gezeigt, dass Pyridin-Zusätze zum Puffer eine weitere Beschleunigung induzieren, mit vollständigem Nucleotideinbau innerhalb von Minuten [8]. Abbildung 3 zeigt eine neue Variante dieser Reaktion, bei der Immobilisierung auf Sepharosepartikeln und aminoterminaler Primer kombiniert werden, um die genetische Information an einem Locus einer RNA-Sequenz linear zu amplifizieren. Für den Einbau von C wurde in Vorversuchen ein Amplifikationsfaktor von ca. 4 erreicht.

Wird der verlängerte Primer nach jeder Einzelreaktion weggewaschen und akkumuliert, kann auch im 27. Zyklus noch die Identität der Templatbase durch rein chemisches Ablesen bestimmt werden (Abb. 3b). Chemische Primerverlängerungsreaktionen mit aminoterminalem Primer sind auch mit basenspezifisch fluoreszierenden Monomeren erfolgreich durchgeführt worden [9][10]. Diese erlauben es Sequenzinformation optisch auszulesen, und dies auch parallel für unterschiedliche Sequenzen auf einem Microarray.

Unsere gegenwärtigen Untersuchungen konzentrieren sich dabei auf eine Vorgehensweise, die bei der Sequenzierung „reversible termination“ genannt wird. Hier wird wie bei etablierten Sequenzierungsmethoden der zweiten Generation eine synchronisierte, stufenweise Auslesung von Sequenzinformation des Templatstranges durch Schutzgruppen erreicht, die sich unter nicht denaturierenden Bedingungen abspalten lassen.

Fazit

Während das Wegwaschen von Produkten oder hydrolysierten Monomeren technisch leicht umzusetzen ist, ergeben sich für die effiziente Ablesung von RNA unter potentiell präbiotischen Bedingungen interessante Szenarios. In Betracht gezogen werden u.a. ein Fluss von aktivierten Monomeren, die an einer chemischen Aktivierungsquelle gebildet wurden, über RNA-Stränge, die auf einer mineralischen Oberfläche adsorbiert sind. Alternativ könnte der periodische Kontakt zweier Reservoirs, von denen eines durch Eindampfen im Sonnenlicht gute Voraussetzungen für eine Aktivierung bietet, durch Gezeiten in Frage kommen, denn ein hoher Salzgehalt der Lösung beschleunigt chemische Primerverlängerungsreaktionen.

Aber auch eine in situ-Reaktivierung von Monomeren an reaktiven Stellen, wie bestimmten Tiefseequellen, ist nicht ausgeschlossen. Die Temperaturabhängigkeit der chemischen Primerverlängerung von RNA spricht jedoch eher für eine kühle Umgebung [11]. Als großes Problem bleibt die Fehlerrate bei der enzymfreien Primerverlängerung im Raum. Punktuelle Daten von RNA-Systemen und systematische Untersuchungen an DNA-Systemen [6] legen nahe, dass bei ungünstigen Sequenzen erheblicher Fehleinbau (über 10%) erfolgen kann, was zu einer raschen Mutation der genetischen Information führen würde.

Die kommenden Untersuchungen werden zeigen ob die Nichtverlängerung der terminal fehlgepaarten Duplexe ein ausreichendes Selbstkorrektiv ist oder ob noch bessere Reaktionsbedingungen gefunden werden müssen, um effiziente und hochselektive chemische Kopiervorgänge zu beobachten. Die zwei Blickrichtungen (präbiotische Chemie und praktische Anwendung) werden das Gebiet der chemischen Primerverlängerung dabei weiter spannend halten.

Literatur

[1] Orgel L. E.: Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39, 99–123 (2004)

[2] S ulston J. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59, 726 (1968)

[3] Deck C. et al.: Nature Chem. 3, 603–608 (2011)

[4] Rajamani S. et al.: J. Am. Chem. Soc. 132, 5880–5885 (2010)

[5] Röthlingshöfer M. und Richert C.: J. Org. Chem. 75, 3945–3952 (2010)

[6] Kervio E. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 12074–12079 (2010)

[7] Schrum J. P. et al.: J. Am. Chem. Soc. 131, 14560–14570 (2009)

[8] Röthlingshöfer M. et al.: Angew. Chem. 120, 6154–6157 (2008)

[9] Gießler K. et al.: Eur. J. Org. Chem. 19, 3611–3620 (2010)

[10] Griesang N. et al.: Angew. Chem. 118, 6290–6294 (2006)

[11] Vogel S. R. und Richert C.: Chem. Commun. 43, 1896–1898 (2007)

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