Der Brückenschlag zwischen Makro- und Mikroebene

Bildgebende Verfahren in der Biofilmanalytik

  • Abb. 1: Aufnahme eines reifenden Biofilms. Gut zu erkennen sind die zahlreichen Mushroom-Strukturen. Rechts ein CLSM-3D-Komposit  eines Bereiches mit Mushrooms und Hohlräumen.
Bei der Analyse von auf Oberflächen assoziierten Mikroorganismen kann man heutzutage auf die gesamte Bandbreite analytischer Methoden zurückgreifen; allerdings sind diese zumeist indirekter Natur und aufwendig (Sensoren, Marker, etc.). Einfacher und unmittelbarer sind dagegen bildgebende Verfahren wie die konfokale Laserscanningmikroskopie und die insbesondere in der Medizin immer populärer werdende optische Kohärenztomographie. Der Clou: Bildgebende Verfahren können immer öfter kombiniert werden.

Charakteristik von Biofilmen

Biofilme sind einer allgemeinen Definition nach an Oberflächen assoziierte Mikroorganismen und darüber hinaus die in der Natur vorherrschende Daseinsform von Mikroorganismen [1]. Biofilme sind vorteilhaft, weil sie es den Mikroorganismen ermöglichen, harschen Umwelteinflüssen besser zu widerstehen als einzelne Zellen oder suspendiert (freischwebend) z. B. in der Wassersäule. Vorteile des Wachstums im Biofilm sind z.B. der Widerstand gegen biologisch aktive Verbindungen (z. B. Antibiotika), aber auch etwa eine höhere Toleranz gegenüber Temperatur- und Trockenstress. Dies macht Biofilme insbesondere in der Medizin zu einem wichtigen Forschungsgebiet, da sie bspw. bei Implantaten Probleme verursachen können und gegenüber regulärer Therapie resistenter sind. Aber auch für die Industrie können sie von Interesse sein. Biofilme als Produktionsorganismen werden bereits für die Herstellung von Ethanol, Essigsäure und Butanol verwendet, sowie für Feinchemikalien. Sie sind von Interesse, da die Selbstimmobilisation der Biofilme das anschließende Downstream-Processing erleichtert, sofern extrazelluläre Produkte kontinuierlich mit dem Biofilm hergestellt werden. Die Selbstimmobilisation der Zellen findet bereits bei der ersten Adhäsion einzelner Zellen oder Pionierfragmente auf Oberflächen statt. Während des Koloniewachstums betten sich die Zellen in eine Matrix aus Polysacchariden, Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren ein, die sogenannten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS). Die EPS ist maßgeblich an der Widerstands- und Haftkraft der Biofilme beteiligt.

Bildgebende Verfahren in der Biofilmanalytik

Bildgebende Verfahren in der Bioprozesstechnik werden bereits seit langen vielfältig eingesetzt.

Neben diversen mikroskopischen Verfahren (konventionelle Lichtmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie) werden auch zunehmend moderne Verfahren wie die Computertomographie, Magnetresonanztomographie, Sonographie, oder Elektro-Impedanz-Tomographie eingesetzt [2,3,4]. Nicht alle sind für die Analyse von Biofilmen anwendbar, da etwa die Elektronenmikroskopie durch die Notwendigkeit der Probenvorbereitung nicht geeignet ist, lebende Systeme zu betrachten. Beim Rasterkraftmikroskop hingegen kann die Elastizität des Biofilms die Messung beeinflussen und das Ergebnis verfälschen. Indirekte Verfahren wie Sonden sind ohnehin nur begrenzt einsetzbar, da je nach Sensortyp in das Wachstumsverhalten des Biofilms eingegriffen wird, oder dieser den Sensor gänzlich überwuchert und eine Messung unmöglich macht. So können z. B.
L. lactis Biofilme etwa Schichtdicken im Millimeterbereich erreichen [5]. Nichtinvasive Methoden sind also vorzuziehen, wenn man den Biofilm als lebendes System untersuchen will. Für die in situ Analyse im laufenden Experiment bieten sich daher insbesondere lichtmikroskopische Techniken an.

Konfokalmikroskopie

Die konfokale Laserscanningmikroskopie (CLSM) kann, je nach Aufbau und Biofilmdicke, Strukturen bis in den Nanometerbereich auflösen. Bei der Verwendung eines aufrechten Systems, d. h. Lichtquelle und Objektiv befinden sich auf derselben Seite der Probe, kann sogar das Wachstum von Biofilmen auf nicht transparenten Oberflächen wie Edelstahl, Titan oder Kunststoffen untersucht werden. Dies ist für industrielle Anwendungen von Vorteil, bei denen solche Materialien in der Regel zur Anwendung kommen. Konfokalmikroskopie kann sowohl örtlich als auch zeitlich aufgelöst Einblicke in das Innenleben eines Biofilms geben. Mit den entsprechenden Einstellungen ist es möglich, bei wachsenden Biofilmen Strukturaufklärung zu betreiben, um sog. Mushroom-Strukturen, aber auch Rinnen und Kanäle zu lokalisieren. Auf zeitlicher Ebene sind Beobachtungen des Wachstums der Zellen im Biofilm oder die Konvektion oder Diffusion von Stoffen durch den Biofilm möglich. Begrenzt sind hier allerdings die Scangeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Auflösung und das Sehfeld, welches direkt von der numerischen Apertur des verwendeten Objektivs abhängt (z. B. Leica SP5 II: 400 – 1400 Hz Scangeschwindigkeit, 1,55 mm - <10 µm Sehfeld).

Optische Kohärenztomographie

Die Optische Kohärenztomographie (OCT) ist ein Verfahren, bei dem im Gegensatz zur Konfokalmikroskopie nicht mit diskreten Laserwellenlängen gearbeitet wird, sondern eine Lichtquelle im Infrarotbereich mit Zentralwellenlängen von 900 – 1300 nm verwendet wird. Das Prinzip beruht auf der Weißlichtinterferometrie, bei der die Verstärkung, bzw. Auslöschung eines Probe- und Referenzstrahls, basierend auf einer Phasenverschiebung in Probe, benutzt werden, um ein Bild zu erzeugen. Der große Vorteil der OCT ist die hohe Aufnahmerate – kommerzielle Systeme erreichen über 200 kHz – und die hohe Eindringtiefe (bis zu 3 mm in geeignetem Material). Nachteil gegenüber dem CLSM ist die geringere Auflösung, die für ein System mit einer 930 nm Lichtquelle bei rund 6 µm liegt. Somit kann OCT zwar nicht auf Zellebene auflösen, aber durch die große Eindringtiefe können Strukturen und Topologien in einem größeren Maße als mit dem Konfokalmikroskop untersucht werden. Dazu kommt das wesentlich größere Sehfeld (z.B. Thorlabs Ganymede: bis 20 mm) im Vergleich zum Konfokalmikroskop. Ein häufiges Einsatzgebiet der optischen Kohärenztomographie ist die Augenheilkunde, da die Methode nicht invasiv und schnell die Untersuchung z.B. des Augenhintergrundes ermöglicht [6].

Kombinierte Verfahren - zusammen ist man stärker

Für sich genommen müssen also beide Geräte gegeneinander abgewogen und die beste Methode für den jeweiligen Zweck ausgewählt werden. Noch weitreichendere Anwendungen ergeben sich durch die Kombination beider Verfahren. Versuche, bei denen Messungen von OCT und CLSM kombiniert wurden, wurden schon im Jahre 2010 [7] durchgeführt. Hierbei fanden die Messungen in getrennten Systemen zeitlich versetzt statt und die beobachteten Bereiche konnten nicht einwandfrei korreliert werden, was u.A. auf die im Vergleich zu heute weniger entwickelte Datenprozessierung zurückzuführen ist.
Innerhalb des Sonderforschungsbereich 926 „Bauteiloberflächen: Morphologie auf der Mikroskala“ wird intensiv der Zusammenhang zwischen Oberflächenstruktur und der Adhäsion von produktiven Biofilmen untersucht [8]. Nur unter Verwendung eines konfokalen Laserscanningmikroskops wäre es nicht möglich, die Morphologie des gesamten Biofilms sicher und schnell zu untersuchen, während die Auflösung des OCT nicht ausreicht, um einzelne Bereiche auf Zellebene aufzulösen. Beides ist aber notwendig, um die Vorgänge bei der Ausbildung von Biofilmstrukturen detailliert beschreiben zu können. In Kombination ist es möglich, den gesamten Biofilm per OCT zu erfassen und dann in interessanten Bereichen (Region of Interest, ROI) Messungen mit dem CLSM durchzuführen.

Weiterhin sind Biofilme nicht völlig homogen. Während der Reifungsphase bilden Biofilme dichtere, höher wachsende Strukturen, die sog. Mushrooms, Kanäle und Gräben und einfache, weniger dichte Bereiche. Wie diese in Beziehung zueinander stehen kann mit den kombinierten Verfahren untersucht werden. Durch Einsatz von ortsaufgelösten Probenahmesystemen kann letztendlich auch bis zur metabolischen Aktivität und dem Genom (z. B. mittels qPCR) in bestimmten Bereichen aufgelöst werden. Unter der Verwendung von Durchflusszellen ist darüber hinaus die Beobachtung in situ, also am lebenden, wachsenden Biofilm möglich. Auf diese Art und Weise ist eine zeitlich aufgelöste Analytik möglich. Interessante Bereiche des Biofilms können mittels OCT identifiziert und diese dann mittels CLSM näher untersucht werden. So können oben erwähnte Mushrooms identifiziert und dann in den Strukturen Analysen z.B. mittels FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) durchgeführt werden, ohne die Probe zu bewegen oder die Kultivierung zu unterbrechen. Die eigentliche Schwierigkeit liegt allerdings nicht bei Kombination der beiden optischen Verfahren, sondern bei der Prozessierung der enormen Datenmengen, die bei den Aufnahmen anfallen. Zu deren Auswertung werden leistungsfähige Programme benötigt, die u. a. auch unter Zuhilfenahme multivariater Verfahren die entscheidenden Informationen aus der Datenflut extrahieren können. Wie eine aktuelle Studie [9] zeigt, ist es möglich, CLSM und OCT nicht nur als sich ergänzende Systeme zu nutzen, sondern auch eine integrierte Experimentalbasis zu schaffen, innerhalb der es möglich ist in extrem kurzer Zeit von der Meso- auf die Mikroebene zu wechseln und diese Daten auf breiter Basis zu verwerten. Wie auch die interdisziplinäre Forschung immer mehr an Bedeutung gewinnt, muss dieser Entwicklung auch auf experimenteller Ebene Rechnung getragen werden; die effektive Kombination von bestehenden Systemen ist mit Sicherheit ein großer Schritt in diese Richtung.

Autoren
Jonas Chodorski1, Daniel Kleine1, Roland Ulber1
 

Zugehörigkeit
1Lehrgebiet Bioverfahrenstechnik, Technische Universität Kaiserslautern, Deutschland

Kontakt
Prof. Dr. Roland Ulber
Lehrgebiet Bioverfahrenstechnik
Technische Universität Kaiserslautern
Kaiserslautern, Deutschland
ulber@mv.uni-kl.de

Literatur

[1] Flemming HC. Are Biofilms the prevalent way of life?. Biofilms 8, 2018, Aarhus
[2] Denkhaus E, Meisen S, Telgheder U, Wingender J. Chemical and physical methods for characterisation of biofilms. Microchim Acta 158, 1–27 (2007) DOI 10.1007/s00604-006-0688-5
[3] Horn H, Staudt C, Neu T, Leon-Ohl A, Bößmann M, Hempel DC. Untersuchungsmethoden für Biofilmsysteme. Chemie Ingenieur Technik (2004), 76, No. 3
[4] Stöckl M, Schlegel C, Sydow A, Holtmann D, Ulber R, Mangold KM. Membrane Separated Flow Cell for Parallelized Electrochemical Impedance Spectroscopy and Confocal Laser Scanning Microscopy to Characterize Electro-Active Microorganisms, Electrochim. Acta 220 (2016) 444-452
[5] Schlegel C, Chodorski J, Huster M, Davoudi N, Huttenlochner K, Bohley M, Reichenbach I, Buhl S, Breuninger P, Müller-Renno C, Ziegler C, Aurich JC, Antonyuk S, Ulber R: Analyzing the influence of microstructured surfaces on the lactic acid production of Lactobacillus delbrueckii lactis in a flow-through cell system, Eng. Life Sci. 17 (2017) 865-873.
[6] Grulkowski I, Liu JJ, Potsaid B, Jayaraman V, Lu CD, Jiang J, Cable AE, Duker JS, Fujimoto JG. Retinal, anterior segment and full eye imaging using ultrahigh speed swept source OCT with vertical-cavity surface emitting lasers Biomed. Opt. Expr. Vol. 3, Issue 11, pp. 2733-2751 (2012)
[7] Wagner M, Taherzadeh D, Haisch C, Horn H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol. Bioeng. 107(5), 844-853, (2010). DOI: 10.1002/bit.22864
[8] Davoudi N, Huttenlochner K, Chodorski J, Schlegel C, Bohley M, Müller-Renno C, Aurich JC, Ulber R, Ziegler C. Adhesion forces of the sea-water bacterium Paracoccus seriniphilus on titanium: Influence of microstructures and environmental conditions. Biointerphases 12 (2017) 05G606.
[9] Andreana M, Sentosa R, Erkkilä MT, Drexler W, Unterhuber A. Depth resolved label-fre multimodal optical imaging platform to study morpho-molecular composition of tissue. Photochem. Photobiol. Sci. 18, 997. 2019. DOI: 10.1039/c8pp00410b

Sfb an der TU Kaiserslautern
 

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