Die neueren Wege der Durchflusszytometrie

Zellsortierung und Einzelzellsequenzierung

  • Abb. 1: Schematische Übersicht des Arbeitsprinzips der klassischen Durchflusszytometrie. A) Schematische Darstellung einer Zelle beim durchfließen des blauen Anregungslasers – es werden neben den Streulichtparametern (FSC und SSC) auch die Fluoreszenz der angeregten Farbstoffe auf den Antikörpern durch ein Linsensystem gesammelt. B) Das gesammelte Fluoreszenzlicht wird in der Detektionseinheit mittels Langpass- und Bandpassfiltern in bestimmte spektrale Bereiche aufgetrennt. Diese Farbbereiche sind weitestgehend spezifisch für die jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, welche die bestimmten Antikörper markieren. C) Die Intensität der jeweiligen Farbstoffe und die Stärke der Lichtstreuung wird in 2D Zytogrammen aufgetragen. Kombinatorisches Gating erlaubt es die Zellen des humanen Blutes entsprechend der Färbung zu klassifizieren. Hierbei gibt es über tausend verschiedene Möglichkeiten und Antikörperkombinationen – die Analytik wird jedes Jahr zunehmend komplexer und genauer.Abb. 1: Schematische Übersicht des Arbeitsprinzips der klassischen Durchflusszytometrie. A) Schematische Darstellung einer Zelle beim durchfließen des blauen Anregungslasers – es werden neben den Streulichtparametern (FSC und SSC) auch die Fluoreszenz der angeregten Farbstoffe auf den Antikörpern durch ein Linsensystem gesammelt. B) Das gesammelte Fluoreszenzlicht wird in der Detektionseinheit mittels Langpass- und Bandpassfiltern in bestimmte spektrale Bereiche aufgetrennt. Diese Farbbereiche sind weitestgehend spezifisch für die jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, welche die bestimmten Antikörper markieren. C) Die Intensität der jeweiligen Farbstoffe und die Stärke der Lichtstreuung wird in 2D Zytogrammen aufgetragen. Kombinatorisches Gating erlaubt es die Zellen des humanen Blutes entsprechend der Färbung zu klassifizieren. Hierbei gibt es über tausend verschiedene Möglichkeiten und Antikörperkombinationen – die Analytik wird jedes Jahr zunehmend komplexer und genauer.
  • Abb. 1: Schematische Übersicht des Arbeitsprinzips der klassischen Durchflusszytometrie. A) Schematische Darstellung einer Zelle beim durchfließen des blauen Anregungslasers – es werden neben den Streulichtparametern (FSC und SSC) auch die Fluoreszenz der angeregten Farbstoffe auf den Antikörpern durch ein Linsensystem gesammelt. B) Das gesammelte Fluoreszenzlicht wird in der Detektionseinheit mittels Langpass- und Bandpassfiltern in bestimmte spektrale Bereiche aufgetrennt. Diese Farbbereiche sind weitestgehend spezifisch für die jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffe, welche die bestimmten Antikörper markieren. C) Die Intensität der jeweiligen Farbstoffe und die Stärke der Lichtstreuung wird in 2D Zytogrammen aufgetragen. Kombinatorisches Gating erlaubt es die Zellen des humanen Blutes entsprechend der Färbung zu klassifizieren. Hierbei gibt es über tausend verschiedene Möglichkeiten und Antikörperkombinationen – die Analytik wird jedes Jahr zunehmend komplexer und genauer.
  • Abb. 2: Schematischer Überblick über die Laborabläufe für eine Einzelzellsequenzierung mittels FACS und SmartSeq. A) Die Zellsortierung mittels elektrostatischer Einzeltropfensortierung erlaubt es einzelne Zellen gezielt in Mikrotitier PCR-Platten zu sortieren. B) Ablauf SmartSeq - die in die PCR Platten sortierten Einzelzellen werden nun jeweils einzeln im Well mittels RT in cDNA umgeschrieben und tagmentiert. Danach wird die Qualität eines jeden Wells überprüft und einzeln mit einem Barcode modifiziert, damit die cDNA-Libraries für die Sequenzierung gepoolt werden können. Die Sequenzierung von allen Zellen (100- x’000!) läuft dann parallel auf dem gleichen Sequenzierer ab und die Daten werden parallel in einem Ansatz bioinformatisch analysiert. C) Die Ergebnisse der Einzelzellsequenzierungen werden in die jeweiligen Samples/Testbedingungen aufgeteilt, auf Qualität verglichen und dann oftmals über dimensionsreduzierende Analysen (Principle Component oder tSNE Analytik) verglichen.
Die Durchflusszytometrie ist eine bereits seit einigen Jahrzehnten bewährte Methode in der Forschungstechnologie mit den ersten großen Entwicklungssprüngen in den 1960iger Jahren und einer starken Kommerzialisierung seit 1980.
Die Methode basiert auf der schnellen Charakterisierung von Zellen mittels fluoreszenzmarkierter Proben (Biochemische Farbstoffe, DNA Farbstoffe, Antikörper). Hierfür werden einzelne Zellen gefärbt und im Strom einer Puffersuspension durch eine Reihe von Anregungslasern in hoher Frequenz bewegt. Die gefärbten Zellen emittieren spezifische Fluoreszenzsignale, entsprechend Ihrer Markierung mit verschiedenen Fluoreszenzproben, die dann über eine Reihe von Spektralfiltern in einzelne Bereiche des emittierten Lichts aufgespalten werden. Die Bereiche des Spektrums, welche spezifische Photonen der korrespondierenden Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, werden dann mittels Lichtdetektoren (APDs, PMTs, CCDs) erfasst und quantifiziert. Aus den gewonnenen Daten der einzelnen Zellen kann man multidimensionale Analysen über die Menge einzelner Marker auf einzelnen Zellen erhalten und so Zellen phänotypisieren. Das Standardblutbild ist hier die einfachste aber auch am meisten verwendete Anwendung (Abb. 1).
Neben der klassischen, phänotypisierenden Durchflusszytometrie gibt es auch noch die Zellsortierung. Hier bedient man sich der gleichen Prinzipien der oben beschriebenen Analyse, wobei die vereinzelten Zellen in der Pufferlösung aus dem System durch eine Düse herausschießen und die so entstehenden einzelnen Tröpfchen gezielt mittels elektrostatischer Ladungen auftrennt werden [1]. Diese Technik erlaubt eine hohe Durchsatzfrequenz mit teilweise bis zu 20-30.000 Zellen pro Sekunde. Dabei ist diese Methode aber vor allem sehr genau und flexibel. Diese Flexibilität bezieht sich nicht nur auf die vielen Parameter pro Zelle, die analysiert werden können, während Zellen spezifisch sortiert werden, sondern auch darauf, welche Versuche und Methoden im Anschluss auf die Sortierung erfolgen.
 
Zellsortierung und Einzelzellsequenzierung
Seit ca. 6 Jahren wird die Zellsortierung sehr stark zusammen mit der Einzelzellsequenzierung verwendet [2].

Hier wird jeweils eine einzelne Zelle in ein Reaktionsvolumen (PCR-Cup oder –Platte) abgelegt, in dem ein sehr sauberer, lytischer Puffer vorliegt – ca. 1-4 µl. Die am meisten genutzten Zellsortierer gekoppelten Sequenzierungsmethoden sind SmartSeq2 und MARSeq [3,4]. Bei diesen Methoden nutzt man die Fähigkeit der Druchflusszytometrie, Zellen während der Sortierung genau zu charakterisieren und dann einzelne Zellen herauszupicken. Dies lässt sich besonders gut auf Gewebeproben und flüssige Biopsien anwenden, da hier die Zytometrie die Integrität - also die Gesundheit - der sortierten Zellen sicherstellen kann. Außerdem werden die Oberflächenmarker analysiert, sodass bestimmte Zellen auswählt werden können, die mittels Einzelzellsequenzierung genauer analysieren werden sollen. Mit der richtigen Ausstattung und guter Automatisierung ist es möglich einige tausend Zelle parallel genomisch zu analysieren (Abb. 2).

 
Droplet Seqeuncing (DropSeq)
Stark im Kommen ist aber seit 3 Jahren die Einzelzellsequenzierung mittels DropSeq [5,6,7]. Bei dieser Methode werden die Zellen nicht einzeln elektrostatisch sortiert, sondern in einem Mikrofluidikchip zusammen mit allen nötigen Reagenzien in kleine Lipidvesikel eingeschlossen. Die Vesikel ersetzen die 96/384 PCR Platten und die Einzelzellsequenzierung wird über vesikelspezifische Barcodes sichergestellt (Für eine genaue Erklärung siehe [3]. Wichtig für das Verständnis der Unterschiede dieser Methoden sind folgende drei Punkte:
  • 1. DropSeq-Methoden funktionieren rein stochastisch und ohne vorgeschaltete Phänotypisierung mittels Antikörperfärbung. Will man in hoher Zahl spezifische Zelltypen analysieren, muss diese vorher aufreinigt werden (mit FACS oder MACS). Die Stochastik ist limitierend, wenn sehr niedrige Frequenzen an Zielzellen in der gesamt Zellsuspension vorhanden sind (ab ca. 1%). Ein DropSeq-Experiment basiert meistens auf 5.000-10.000 Zellen und bei einer Zielzellenfrequenz von 1% sind das 50-100 Zellen, bei 0.1% nur noch 5-10 Zellen.
  • 2. DropSeq-Methoden sind meistens auf 3’/5’ ausgelegte Sequenzierungsmethoden ausgelegt. Das heißt, dass damit die Zahl an mRNA Kopien sehr gut festgestellt werden kann, aber leider keine Aussage über eventuelle SNPs oder alternative Spliceprodukte gemacht werden können.
  • 3. SmartSeq oder MARSeq sind labortechnisch aufwendiger, da sie noch sehr viel händische Zuarbeit benötigen. Jedoch ermöglichen diese das Sequenzieren der ganzen mRNA oder DNA. Diese Methoden sind zeitintensiver, aber dafür variabler und besser adaptierbar.
  • 4. In bestimmten Fällen bietet sich ein gezielter (targeted) Sequenzierungsansatz eher an als alle in der Zelle vorhandenen mRNAs zu detektieren. Das ist vor allem dann der Fall, wenn die Ziel-RNAs in nur sehr geringer Zahl vorkommen. Zwar verliert sich die Möglichkeit, die globale Expression zu betrachten, aber die Stochastik und die Ineffizienz der reversen Transkription wird dadurch ausgehebelt und die Chance, interessante Transkripte zu untersuchen, verbessert.
Für sehr viele Anwendungen, besonders die Phänotypisierung im Verbund mit simplen Expressionstudien, ist DropSeq allemal ausreichend und deshalb im Einzelzellfeld so sehr beliebt. Jedoch ist DropSeq auch kein Alleskönner und man muss sehr genau auf die Qualität des Zellmaterials achten. Denn bei DropSeq kann, sobald der Lauf gestartet ist, nicht mehr steuernd eingegriffen werden. Die toten oder minderwertigeren Zellen sind für die Methode ebenso ein gleichwertiges Ziel wie die lebenden Zellen der Probe. Am Ende wird alles sequenziert – auch die ungewünschten Nucleotide sterbender Zellen. Deshalb ist es essentiell, die Population vor dem Experiment von Apoptose-Material zu befreien – hier bieten sich die klassisches FACS Aufreinigung oder eine MACS Säule an. Viele Anwender sehen diesen Punkt als nicht so kritisch an, aber leider ist das ein Trugschluss. Die Einzelzellsequenzierung ist an sich sehr empfindlich und in der Lage auch geringe Änderungen in der Expression von RNAs zu detektieren. Nur wird die Interpretation der Daten schwieriger, wenn nicht genau gesagt werden kann, ob das Material auch wirklich perfekt für die Analyse geeignet war.
 
Flaschenhals reverse Transkription
Bei allen Einzelzellmethoden ist der wichtigste Schritt, eine sehr gute reverse Transkription (RT) zu ermöglichen. An diesem Schritt hängt sehr viel, denn wenn die RT nicht gut funktioniert, dann sind auch alle weiteren Schritte davon betroffen und natürlich auch das Ergebnis der Sequenzierung. Leider ist eine RT niemals zu 100% effektiv – im Falle von Einzelzellsequenzierungen kann man von einer Effizienz von 20-30% ausgehen.
Was bedeutet das praktisch für den Wissenschaftler? Es bedeutet vor allem, dass bei der Einzelzellsequenzierung niemals alle in der Zelle exprimierten Gene detektieren werden. Stark exprimierte Gene, wie z.B. Housekeeping Gene (GAPDH, bActin, etc), werden immer in den Sequenzen gut wiedergefunden, aber gerade solche Gene, die nur sehr wenige mRNA-Kopien haben wird man nicht immer nachweisen. Die Stochastik der RT wird erst bei der Einzelzellsequenzierung wirklich sichtbar [8]. Es empfiehlt sich daher immer die Summe aller mit Einzelzellsequenzierung detektierten Gene in den Zellen -  das können einige hundert oder tausende Zellen sein - mit einer „Bulkprobe“ zu vergleichen. Stimmen die detektierten Gene der kombinierten Einzelzelldaten mit dem „Bulk“ in Ihrer Zahl und Menge gut miteinander überein, so kann vermutet werden, dass die vielleicht beobachtete Variabilität der Genexpression auf der Einzelzellebene eine intrinsische und keine extrinsische, durch die Analysemethodik eingebrachte, Variabilität handelt – vor allem, wenn man weiß dass das Material von perfekter Qualität war. In diesem Punkt werden Einzelzellanalyse und Sortierung mittels FACS und die Sequenzierung der jeweiligen Nucleinsäuren noch einen sehr langen gemeinsamen Weg gehen. Am EMBL ist die Zusammenarbeit zwischen Durchflusszytometrie und Genomik sehr wichtig und auch dadurch unterstrichen, dass gemeinsam mit Anwendern die Experimente geplant werden. Sequenzierungen sind immer noch sehr teuer, vor allem wenn es viele Proben sind. Jede einzelne Zelle ist bei Einzelzellanalysen schließlich eine einzelne Probe. Aber man kann Einzelzellprojekte mit der richtigen Planung erschwinglich und gut interpretierbar gestalten.

 

Author
Malte Paulsen

 

Kontakt
Dr. Malte Paulsen

Leiter der Durchflusszytometrie Core Facility
European Molecular Biology Laboratory
Heidelberg, Deutschland
malte.paulsen@embl.de

 

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Literatur
[1] Shapiro, H.M.: Practical Flow Cytometry (Hoboken, NJ, USA: Wiley-Liss) (2003)
[2] Ziegenhain, C., Vieth, B., Parekh, S., Reinius, B., Guillaumet-Adkins, A., Smets, M., Leonhardt, H., Heyn, H., Hellmann, I., and Enard, W.: Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol. Cell 65, 631–643.e634 (2017)
[3] Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., and Heyn, H.: Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nat Protoc 13, 2742–2757 (2018)
[4] Picelli, S., Faridani, O.R., Björklund, A.K., Winberg, G., Sagasser, S., and Sandberg, R.: Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 9, 171–181 (2014)
[5] Klein, A.M., Mazutis, L., Akartuna, I., Tallapragada, N., Veres, A., Li, V., Peshkin, L., Weitz, D.A., and Kirschner, M.W. (2015). Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell 161, 1187–1201.
[6] Macosko, E.Z., Basu, A., Satija, R., Nemesh, J., Shekhar, K., Goldman, M., Tirosh, I., Bialas, A.R., Kamitaki, N., Martersteck, E.M., et al.: Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell 161, 1202–1214 [2015)
[7] Valihrach, L., Androvic, P., and Kubista, M.: Platforms for Single-Cell Collection and Analysis. Int J Mol Sci 19, 807 (2018)
[8] Ståhlberg, A., and Bengtsson, M.: Single-cell gene expression profiling using reverse transcription quantitative real-time PCR. Methods 50, 282–288 (2010)

 

Kontaktieren

European Molecular Biology Laboratory


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