Die Rettung der Honigbiene?

Bedeutung von Sekundärmetaboliten für Bienenpathogene

  • Abb. 1: A) Ausschnitt des pam-Genclusters und der kodierten NRPS bzw. PKS. Pfeile weisen auf Stellen mit Substratpromiskuität in den entsprechenden ADomänen hin. Die inkorporierten Strukturelemente sind im Dreibuchstabencode angegeben; die gestrichelten Linien weisen auf die entsprechenden Strukturelemente. B) Strukturen der Paenilamicinderivate. Die einzelnen Strukturelemente sind farbig hervorgehoben. R1 und R2 zeigen die variablen Fragmente. C: Kondensationsdomäne; A: Adenylierungsdomäne; T: Thiolierungsdomäne; E: Epimerisierungsdomäne; MT: Methylierungsdomäne; KS: Ketosynthasedomäne; AT: Acyl-Transferasedomäne; KR: Ketoreduktasedomäne; ACP: Acyl-Carrier-Protein.Abb. 1: A) Ausschnitt des pam-Genclusters und der kodierten NRPS bzw. PKS. Pfeile weisen auf Stellen mit Substratpromiskuität in den entsprechenden ADomänen hin. Die inkorporierten Strukturelemente sind im Dreibuchstabencode angegeben; die gestrichelten Linien weisen auf die entsprechenden Strukturelemente. B) Strukturen der Paenilamicinderivate. Die einzelnen Strukturelemente sind farbig hervorgehoben. R1 und R2 zeigen die variablen Fragmente. C: Kondensationsdomäne; A: Adenylierungsdomäne; T: Thiolierungsdomäne; E: Epimerisierungsdomäne; MT: Methylierungsdomäne; KS: Ketosynthasedomäne; AT: Acyl-Transferasedomäne; KR: Ketoreduktasedomäne; ACP: Acyl-Carrier-Protein.
  • Abb. 1: A) Ausschnitt des pam-Genclusters und der kodierten NRPS bzw. PKS. Pfeile weisen auf Stellen mit Substratpromiskuität in den entsprechenden ADomänen hin. Die inkorporierten Strukturelemente sind im Dreibuchstabencode angegeben; die gestrichelten Linien weisen auf die entsprechenden Strukturelemente. B) Strukturen der Paenilamicinderivate. Die einzelnen Strukturelemente sind farbig hervorgehoben. R1 und R2 zeigen die variablen Fragmente. C: Kondensationsdomäne; A: Adenylierungsdomäne; T: Thiolierungsdomäne; E: Epimerisierungsdomäne; MT: Methylierungsdomäne; KS: Ketosynthasedomäne; AT: Acyl-Transferasedomäne; KR: Ketoreduktasedomäne; ACP: Acyl-Carrier-Protein.
  • Abb. 2: Antifungale und antibakterielle Bioaktivität der Paenilamicine. Ein Gemisch aus den vier Paenilamicinderivaten wurde auf antibakterielle (B. megaterium, B. licheniformis, P. alvei) und antifungale (P. pastoris und F. oxysporum) Aktivität getestet. Als Negativkontrolle wurde das Lösungsmittel ohne Paenilamicine verwendet.
  • Abb. 3: In vivo Effekt der Paenilamicine. A) Gesunde Larve (links) und eine mit P. larvae infizierte Larve (rechts). B) Larven wurde Futter mit Sporen von P. larvae und/oder P. alvei verabreicht. In Larven, die mit P. larvae wt infiziert wurden, konnte P. alvei signifikant häufiger überleben, als in Larven, die mit P. larvae ΔpamA infiziert wurden. Hieraus lässt sich schließen, dass die Paenilamicine eine Abtötung von P. alvei bewirken. Die Balken repräsentieren Mittelwerte mit Standardabweichung (SD) von drei Infektionstests mit je 30 Larven, die mit dem t-Test analysiert wurden; * p-Wert <0.05; *** p-Wert <0.001.

Auch Honigbienen werden krank! Zu der Vielzahl von Pathogenen, die die Bienen bedrohen, gehört das Bakterium Paenibacillus larvae, der Verursacher einer tödlichen Erkrankung der Bienenbrut. Ziel unserer Arbeiten ist die Charakterisierung von Sekundärmetaboliten von P. larvae, um ein tieferes Verständnis der Pathogenese dieser bedrohlichen Bienenerkrankung zu erlangen und den Weg für neue Therapieansätze zu bereiten.

Die Honigbiene und die Amerikanische Faulbrut
Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera) ist der wichtigste Bestäuber in vielen landwirtschaftlichen Kulturen und natürlichen Ökosystemen. Werden Bienenvölker zur Bestäubung hochpreisiger Kulturen eingesetzt (z. B. Mandeln in Kalifornien), kann die Honigbiene vom viert- sogar zum drittwichtigsten Nutztier nach dem Schwein und dem Rind avancieren.

Eine signifikante Reduktion des Honigbienenbestandes hätte deshalb neben den ökologischen Folgen auch bedeutsame ökonomische Folgen. Erhebliche Völkerverluste werden weltweit regelmäßig von der Milbe Varroa destructor, die verschiedenen Bienenviren als mechanischer oder biologischer Vektor dient, verursacht. Großen wirtschaftlichen Schaden richtet aber auch die tödliche Brutkrankheit „Amerikanische Faulbrut" an, die jährlich weltweit zum Tod ungezählter Bienenvölker führt.

Die Amerikanische Faulbrut (AFB) ist eine anzeigepflichtige Tierseuche. Der Erreger, das sporenbildende Bakterium P. larvae [1], kommt weltweit vor und verursacht eine tödlich verlaufende Infektion der Bienenbrut. Obwohl nur die Larven erkranken können, führt der Verlust der Nachkommen schließlich zum Zusammenbruch des gesamten Volkes. Eine wirksame Behandlung der Erkrankung ist bislang nicht möglich. Stattdessen werden erkrankte Völker oftmals verbrannt, um eine weitere Ausbreitung der AFB zu verhindern. Die der AFB zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind weitgehend ungeklärt, was diese Krankheit zu einer schwer zu bekämpfenden Tierseuche macht. Ein besseres Verständnis der Strategien, die P. larvae zu einem tödlichen Pathogen machen, würde die Entwicklung neuer Therapiekonzepte ermöglichen.

P. larvae und Sekundärmetabolite
In unserer bioinformatischen Analyse des Genoms von P. larvae fiel das Vorhandensein von mehreren sog. Sekundärmetabolitgenclustern auf. Es stellte sich die Frage, welche Rolle Sekundärmetabolite in der Pathogenese der AFB spielen, und inwieweit diese essentiell für den Erreger sind. Am interessantesten erschienen die nicht-ribosomalen Peptide (NRP) und Polyketide (PK), bzw. Hybridmoleküle (NRP/PK), da für diese Substanzklassen bereits vielfältige Funktionen, u. a. als Antibiotika, Antimykotika, Cytotoxine, Siderophore, aber auch Virulenzfaktoren, beschrieben sind. NRP, PK und NRP/PK werden von großen, modular aufgebauten Multienzymkomplexen synthetisiert, die von entsprechend großen Genclustern (10 - 150 kbp) kodiert werden. Die nicht-ribosomale Synthese mittels NRP-Synthetasen (NRPS) erlaubt den Einbau von nicht-proteinogenen Aminosäuren, darunter z. B. D-Aminosäuren, wodurch die strukturelle Diversität wesentlich größer ist als bei ribosomalen Peptiden. Die Synthese der PK erfolgt über PK-Synthasen (PKS), die keine Aminosäuren sondern Acyleinheiten (üblicherweise Acetyl-CoA bzw. Malonyl-CoA) einbauen.

Die Paenilamicine - aktive nichtribosomale Peptid-Verbindungen aus P. larvae
Im Genom von P. larvae interessierte uns insbesondere ein kryptisches NRPS / PKS-Hybridgencluster (pam-Gencluster) mit einer Länge von ca. 60 kbp (s. Abb. 1A) [3]. Dieses Gencluster kodiert für einen hybriden NRPS-PKS-Enzymkomplex, der die Synthese der Paenilamicine genannten Sekundärmetabolite katalysiert [2]. Die Strukturaufklärung der vier NRP/PK-Hybridverbindungen (Paenilamicin A1, A2, B1 und B2) gelang mittels hochauflösender Orbitrap-Massenspektrometrie, Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie. Die NMR-Spektren zeigen eine besondere Struktur der Kernbausteine, bestehend aus: 2,3,5-Trihydroxypentansäure (Hpa), Ala, N-Methyldiaminopropionsäure (mDap), Galantinsäure (Gla), Gly und 4,3-Spermidin (s. Abb. 1B). Zwei Positionen der vier Pae­nilamicin-Derivate zeigen strukturelle Unterschiede: Das N-terminale Fragment trägt ein decarboxyliertes Lys (Cadaverin, Cad) bzw. ein decarboxyliertes Arg (Agmatin, Agm), die zweite Position, ist ein Lys bzw. Orn im Zentrum der Molekülstruktur (s. Abb. 1) [2].

Entscheidend für die funktionelle Charakterisierung der Paenilamicine in verschiedenen Bioassays war ein erst kürzlich von uns entwickeltes Protokoll zur genetischen Manipulation von P. larvae. Bioaktivitätsassays mit Kulturüberständen von P. larvae Wildtyp-Bakterien oder einer pam-Geninaktivierungsmutante (∆pamA) aber auch mit gereinigten Paenilamicinen zeigten die antibakterielle, antimykotische und cytotoxische Aktivität diese Sekundärmetabolite (s. Abb. 2) [3]. Expositionsbioassays von Bienenlarven mit dem Saprophyten Paenibacillus alvei und P. larvae Wildtypbakterien oder der ∆pamA-Mutante erhellten die biologische Funktion der Paenilamicine während der Pathogenese der AFB - der Kampf gegen Konkurrenten im Larvendarm. Der Wildtypstamm von P. larvae konnte sich gegen P. alvei durchsetzen; die Mutante dagegen konnte das Wachstum von
P. alvei nicht unterdrücken (s. Abb. 3) [2].

Ausblick
Durch die Aufklärung der Struktur und Biosynthese der Paenilamicine haben wir entscheidend zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der AFB beigetragen. Mit dem Nachweis, dass P. larvae über Antibiotika aktiv das Wachstum von mikrobiellen Konkurrenten im Larvendarm unterdrücken kann, konnte endlich geklärt werden, wie P. larvae es schafft, in den zersetzen Larven als Reinkultur vorzukommen. Die Arbeiten am P. larvae Sekundärmetabolismus tragen aber nicht nur dazu bei, die Virulenzmechanismen von P. larvae besser zu verstehen, sondern sie liefern mögliche Ansatzpunkte für neue Therapiekonzepte. Des Weiteren könnten die Paenilamicine wegen ihrer cytotoxischen, antimykotischen und antibakteriellen Aktivität interessante Kandidaten für Wirkstoffentwicklungsprogramme sein. Bis zur Rettung der Honigbiene ist noch ein Stück Weges zurückzulegen, mit den bisherigen Arbeiten konnten wir jedoch einige Schritte in die richtige Richtung gehen.

Referenzen
[1] Genersch E. et al.: Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:501-511 (2006)
[2] Müller S. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. doi: 10.1002/anie.201404572 (2014)
[3] Garcia-Gonzalez E. et al.: MicrobiologyOpen doi: 10.1002/mbo3.195

Autoren
Elke Genersch1,
Eva Garcia-Gonzalez1, Sebastian Müller2, Roderich D. Süssmuth2
1 Länderinstitut für Bienenkunde, Molekulare Mikrobiologie,
Hohen Neuendorf
2 Institut für Chemie, Technische Universität Berlin, Berlin

Kontakt
Prof. Roderich D. Süssmuth
Institut für Chemie, Technische
Universität Berlin
Berlin

PD Dr. Elke Genersch
Länderinstitut f. Bienenkunde,
Molekulare Mikrobiologie
Hohen Neuendorf
www.honigbiene.de

Kontaktieren

TU Berlin
Straße des 17. Juni 135
10623 Berlin
Germany

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