Ein Enzym mit Doppelfunktion

Ceramid Synthase, ein Enzym, das Gene an – und abschalten kann

  • Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Proteinstruktur der Ceramid Synthase (CerS) Schlank an der inneren Kernmembran (INM). (B, B´) mit Fokus auf die Homöo-Domäne (blau) vor (B) und nach (B´) Einfügen einer Mutation in das Kernlokalisations-Motiv 2 (NLS2). Lag1p-Motiv (grün), Transmembran-Domäne (grau). (C) NLS2 Larven sind schlank, (D) sind im Wachstum verlangsamt und zeigen eine erhöhte Expression des Lipase3 (lip3) Gens. Wildtyp Kontrolle (WT), NLS2-Mutanten (NLS2) [3].Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Proteinstruktur der Ceramid Synthase (CerS) Schlank an der inneren Kernmembran (INM). (B, B´) mit Fokus auf die Homöo-Domäne (blau) vor (B) und nach (B´) Einfügen einer Mutation in das Kernlokalisations-Motiv 2 (NLS2). Lag1p-Motiv (grün), Transmembran-Domäne (grau). (C) NLS2 Larven sind schlank, (D) sind im Wachstum verlangsamt und zeigen eine erhöhte Expression des Lipase3 (lip3) Gens. Wildtyp Kontrolle (WT), NLS2-Mutanten (NLS2) [3].
  • Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Proteinstruktur der Ceramid Synthase (CerS) Schlank an der inneren Kernmembran (INM). (B, B´) mit Fokus auf die Homöo-Domäne (blau) vor (B) und nach (B´) Einfügen einer Mutation in das Kernlokalisations-Motiv 2 (NLS2). Lag1p-Motiv (grün), Transmembran-Domäne (grau). (C) NLS2 Larven sind schlank, (D) sind im Wachstum verlangsamt und zeigen eine erhöhte Expression des Lipase3 (lip3) Gens. Wildtyp Kontrolle (WT), NLS2-Mutanten (NLS2) [3].
  • Abb. 2: (A) Die Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) zeigt eine Anreicherung der regulatorischen Region von lip3. Die regulatorische Region eines Kontrollgens (sty) ist nicht angereichert. (B) Reportergen-Aktivität bei Anwesenheit von wildtypischen und von im NLS2-Motiv mutierten Protein-Varianten der Drosophila CerS Schlank und der Säuger CerS2. (C) Transkriptionelle Expression nach Wiedereinbringen von wildtypischen und von im NLS2-Motiv mutierten Protein-Varianten von Schlank und der ­Säuger CerS2 in Tiere mit einer Mutation im NLS2-Motiv [3].
  • Abb. 3: (A) Schematische Darstellung des ex vivo Experiments. Nach Entnahme von Organen (Darm und Fettkörper) erfolgt eine Inkubation mit BSA (Bovine Serum Albumin) als Kontrolle und mit BSA-konjugierten Fettsäuren verschiedener Kettenlänge (C12-, C14-, und C16-Fettsäuren). Danach wird RNA isoliert und die Expression des Gens Lipase3 gemessen. (B) Messung der Lipase3 Expression nach Fettsäure Zugabe in wildtypischen (WT) und mutierten (NLS2) Organen [3].

L ipide (Fette) wurden lange nur als Membranbausteine oder Energiespeicher betrachtet. Doch seit einigen Jahren weiß man, dass sie auch als „bioaktive Lipide“ eine Art Botenstoff mit hormonähnlicher Wirkung fungieren können. Ein Vertreter biologisch aktiver Lipide aus der Klasse der Sphingolipide ist Ceramid, das de novo durch das Enzym Ceramid Synthase (CerS) hergestellt wird. Diese Enzyme sind hochkonserviert, jedoch variiert ihre Anzahl in den verschiedenen Spezies erheblich. Während man in wirbellose Tieren, wie der Taufliege Drosophila melanogaster, nur eine CerS findet, sind es in Säugern deren sechs. Alle CerS-Proteine haben mehrere Transmembran (TM)-Domänen und ein sogenanntes Lag1p Motiv, das für die enzymatische Aktivität notwendig ist. Zusätzlich haben viele CerS noch eine Homöo-Domäne, die man üblicherweise in Transkriptionsfaktoren findet und die DNA binden kann.

Studien in Wirbeltieren und in wirbellose Tiere zeigten, dass CerS und ihr Produkt Ceramid in die Regulation von zahlreichen Zellprozessen wie Zellproliferation, Apoptose, den Insulinsignalweg, neuronale Integrität und Lipid Homöostase involviert sind und somit wiederum auch viele physiologische und pathophysiologische Prozesse beeinflussen. Eine fein abgestimmte Regulation von CerS und ihren Produkten ist deswegen Grundvoraussetzung für einen Lipidstoffwechsel im Gleichgewicht, für Lipidhomöostase.

Analyse der Drosophila Ceramid Synthase „Schlank“

Vorausgegangene Studien zeigten, dass das einzige CerS Gen im Drosophila neben der Funktion als Enzym auch noch einen Einfluss auf Auf- und Abbau von Körperfett hat und deswegen „Schlank“ genannt wurde. Es gab Hinweise, dass die Regulation über die Homöo-Domäne (ein Bereich, der DNA binden kann) erfolgt, genauer gesagt über ein Kernlokalisations-Motiv (NLS2), das mit einem DNA Bindungs-Motiv in der die Homöo-Domäne überlappt [1,2].

Vor diesem Hintergrund wurde die Homöo-Domäne der Drosophila CerS Schlank mithilfe genetischer, molekularbiologischer, proteinbiochemischer und zellbiologischer Methoden näher charakterisiert.

Zuerst wurde ein Tiermodell generiert bei dem durch eine zielgerichtete Mutation das NLS2-Motiv der CerS Homöo-Domäne verändert wurde (Abb.1).

Diese NLS2-Tiere zeigten eine verzögerte Entwicklung und hatten weniger Körperfett, waren also schlank. Zudem war die Aktivität des Gens Lipase3, das dafür zuständig ist, Nahrungsfette zu zerlegen, die dann zur Energiegewinnung eingesetzt werden können, sehr auffällig erhöht (Abb. 1C-E). Da die enzymatische Aktivität von NLS2-Tieren völlig intakt ist, beruhen alle beobachteten Effekte allein auf der Mutation in der Homöo-Domäne.

Chromatin-Immunopräzipitation

Es stellte sich nun die Frage wie das Enzym CerS, ein TM-Protein, über die Homöo-Domäne die Lipase3 steuern kann? Durch die Bindung an DNA? Aus diesem Grund wurde zur funktionellen Analyse der Homöo-Domäne eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) durchgeführt. Hierbei wird das rekombinante CerS Protein, das mit einem Protein-Tag (Hämagglutinin, HA) modifiziert ist, in Drosophila Schneider Zellen exprimiert und zusammen mit dem Chromatin der Zellen isoliert. Anschließend führt man mit einem Antikörper gegen das Protein-Tag (Anti-HA) die Immunpräzipitation der vernetzten Protein-DNA-Komplexe durch. DNA-Protein-Interaktionen findet man oft innerhalb regulatorischer Regionen eines Gens (Promotoren, Enhancer, etc.).

Abbildung 2A zeigt, dass das intakte, wildtypische CerS Protein (HA-WT) nach ChIP an DNA in der regulatorischen Region von Lipase3 bindet und somit angereichert werden kann. Im Gegensatz dazu kann ein CerS Protein mit mutiertem NLS2-Motiv (HA-NLS2), nicht mehr DNA binden.

Fluoreszenz-Reportergen-Analyse

Die regulatorische Kapazität von CerS vermittelt durch die Homöo-Domäne wurde anschließend durch „Reportergenanalysen“ verifiziert. Diese Methode beruht darauf, dass die regulatorische Region eines Genes, z. B. von Lipase3 vor ein Reporter-Gen wie beispielsweise dem Enzym Luciferase, eingebracht wird. Das Enzym Luciferase oxidiert bei Zugabe von Luciferin und ATP das Luciferin, was zu einer messbaren Lichtemission führt.

Bindet nun ein Protein an die regulatorische Lipase3 Region, das entweder aktivierend oder supprimierend wirkt, wird die basale Genaktivität der Luciferase entsprechend erhöht oder erniedrigt. Damit ändert sich dementsprechend auch die zu messende Lichtemission. Wie in Abbildung 2B zu sehen ist, wird die Luciferase Aktivität in Gegenwart des wildtypischen CerS Proteins (HA-WT) reduziert. Das entspricht der Erwartung, da von vorhergehenden Experimenten bekannt war, dass ein hoher Spiegel der CerS Schank Lipase3 Expression supprimiert. Dagegen führt die NLS2-Variante des CerS Proteins zu keiner Repression der Luciferase Reporteraktivität. So wurde bestätigt, dass DNA Bindung der Drosophila CerS Schlank durch die Homöo-Domäne für die transkriptionelle Regulation notwendig ist. Interessanterweise kann auch die Maus CerS2 ebenso wie Schlank die Aktivität der Drosophila Lipase regulieren (Abb. 2B).

Rescue Experimente

Auch in vivo konnte die transkriptionelle Funktion von Schlank auf die Lipase3 Regulation durch ein sogenanntes „Rescue-Experiment“ bestätigt werden. In NLS2-Mutanten, die eine sehr hohe Lipase3 Expression zeigen, wird entweder die intakte oder die mutierte NLS2-Variante des CerS Gens wiedereingesetzt. Ausschließlich die intakte Variante von CerS (HA-WT) konnte die erhöhte Lipase3 Expression wieder auf das wildtypische Niveau reduzieren (Abb. 2C). Fügt man ein intaktes CerS-Gen der Maus in die NLS2-Tiere ein, kann man den gleichen Effekt auf die Lipase3 Regulation beobachten (Abb. 2C). Diese Experimente legen die Vermutung nahe, dass die Homöo-Domäne von CerS in Säugetieren also auch möglicherweise beim Menschen eine ähnliche Funktion übernimmt wie bei Drosophila.

Ex vivo Analyse

Fettsäuren stellen die Ausgangsstoffe für alle bioaktiven Lipide dar. Sie können aber auch als Signalmoleküle die Regulation der Genexpression beeinflussen. Die Verfügbarkeit von Fettsäuren ist gleichfalls die Voraussetzung dafür de novo Ceramide durch die CerS zu generieren. Besteht nun ein Zusammenhang zwischen der Menge an vorhandenen Fettsäuren und der durch Schlank vermittelten Regulation der Transkription? Um dies zu testen wurde ein ex vivo Versuchsansatz entwickelt. Man entnimmt dem Organismus lebendes Gewebe, kultiviert es über einen gewissen Zeitraum und kann es so unter definierten Laborbedingungen testen oder manipulieren. Hier haben wir aus wildtypischen und NLS2-Tieren den Fettkörper und den Darm entnommen (Abb. 3A). In beiden Geweben kann, ähnlich wie beim Säuger im Fettgewebe, Speicherfett in Form sogenannter Lipidtröpfchen, gespeichert werden. Den entnommenen Organen wurden aktivierte Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlänge zugegeben, für 6 Stunden inkubiert und anschließend die Veränderung der Expression von Lipase3 in diesen Geweben untersucht (Abb. 3B).

Wie erwartet, regulierte sich die Menge von Lipase3 in den Geweben der wildtypischen Tiere nach unten. Es ist unter diesen Bedingungen auch nicht notwendig die Expression der Lipasen zu erhöhen, um die Nahrungsfette zur Energiegewinnung zu zerlegen.

Im Gegensatz dazu war im gleichen ex vivo Experiment mit Gewebe aus den NLS2-Tieren das Lipase3 Niveau in keinem Fall reduziert. Die Lipase3 Expression kann nicht an die Situation „guter Nahrungszustand“ (viele Fettsäuren zur Energiegewinnung) angepasst werden.

Fazit

Zusammenfassend lässt sich sagen, durch die Etablierung eines Tiermodells mit einer spezifischen Mutation in der Homöo-Domäne (NLS2) des Enzyms CerS konnte der Nachweis geführt werden, dass die Homöo-Domäne auch in vivo für die Lipid Homöostase essentiell ist. Die NLS2-Mutation führt zum Verlust der DNA-Bindung und infolge dessen zu deregulierter Genexpression. NLS2-Mutanten können in Antwort auf sich verändernde Lipid-Level die Transkription nicht mehr entsprechend anpassen. Unsere Arbeiten zeigen, dass die Drosophila CerS Schlank ein Enzym mit Doppelfunktion ist, das nicht nur einen zentralen Schritt bei der Herstellung von Ceramid katalysiert. Es ist zusätzlich ein transkriptioneller Regulator, der das Lipid-Level messen (Sensing) und diese Information auf die Ebene der Genexpression transduzieren kann. Zudem fand man, dass dieser Mechanismus ebenso bei der Säuger CerS2 konserviert ist.

Autoren
Mariangela Sociale1 und Reinhard Bauer1

Zugehörigkeit
1LIMES Institut, Entwicklungsgenetik & Molekulare Physiologie, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Kontakt  
Dr. Reinhard Bauer

LIMES Institut
Entwicklungsgenetik & Molekulare Physiologie
Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität
Bonn, Deutschland
r.bauer@uni-bonn.de

Referenzen
[1] Bauer, R., Voelzmann, A., Breiden, B., Schepers, U., Farwanah, H., Hahn, I., Eckardt, F., Sandhoff, K., and Hoch, M. (2009). Schlank, a member of the ceramide synthase family controls growth and body fat in Drosophila. EMBO J 28, 3706-3716.
[2] Voelzmann, A., Wulf, A.L., Eckardt, F., Thielisch, M., Brondolin, M., Pesch, Y.Y., Sociale, M., Bauer, R., and Hoch, M. (2016). Nuclear Drosophila CerS Schlank regulates lipid homeostasis via the homeodomain, independent of the lag1p motif. FEBS letters 590, 971-981.

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Carl-Troll Str. 31
53115 Bonn
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