Ein NMR-Blick auf virale Hüllproteine

Wie Noroviren ihre Vorliebe für Süßes zügeln

  • Abb: 1: a) Spuren aus HNCACB (black) und HN(CO)CACB Spektren (rot und blau) bei den 1HN und 15N chemischen Verschiebungen von isoD373, D374, und F375. Das Kreuzsignal an der 13C chemischen Verschiebung von D374 ist negativ (blau) und zeigt an, dass die „Peptidbindung“nun über die Seitenkette des deamidierten Asn Restes in Position 373 verläuft, also ein iso-Asp (isoD373) darstellt. b) 1H,15N TROSY HSQC des nativen Saga P-dimers (red) und des deamidierten, post-translational modifizierten Saga P-Dimers (blau). c) CSPs, die durch irreversible Deamidierung von N373 herrühren. Gestrichelte Linien zeigen die 2s Linie (rote Balken) und die experimentell ermittelte Nachweisgrenze von 7.9 Hz (orangene Balken) an. d) Abbildung der CSPs auf der Kristallstruktur des P-Dimers, das mit B Trisaccharid (pdb: 4X06) komplexiert ist. Modifizierte Abbildung aus [1].Abb: 1: a) Spuren aus HNCACB (black) und HN(CO)CACB Spektren (rot und blau) bei den 1HN und 15N chemischen Verschiebungen von isoD373, D374, und F375. Das Kreuzsignal an der 13C chemischen Verschiebung von D374 ist negativ (blau) und zeigt an, dass die „Peptidbindung“nun über die Seitenkette des deamidierten Asn Restes in Position 373 verläuft, also ein iso-Asp (isoD373) darstellt. b) 1H,15N TROSY HSQC des nativen Saga P-dimers (red) und des deamidierten, post-translational modifizierten Saga P-Dimers (blau). c) CSPs, die durch irreversible Deamidierung von N373 herrühren. Gestrichelte Linien zeigen die 2s Linie (rote Balken) und die experimentell ermittelte Nachweisgrenze von 7.9 Hz (orangene Balken) an. d) Abbildung der CSPs auf der Kristallstruktur des P-Dimers, das mit B Trisaccharid (pdb: 4X06) komplexiert ist. Modifizierte Abbildung aus [1].
  • Abb: 1: a) Spuren aus HNCACB (black) und HN(CO)CACB Spektren (rot und blau) bei den 1HN und 15N chemischen Verschiebungen von isoD373, D374, und F375. Das Kreuzsignal an der 13C chemischen Verschiebung von D374 ist negativ (blau) und zeigt an, dass die „Peptidbindung“nun über die Seitenkette des deamidierten Asn Restes in Position 373 verläuft, also ein iso-Asp (isoD373) darstellt. b) 1H,15N TROSY HSQC des nativen Saga P-dimers (red) und des deamidierten, post-translational modifizierten Saga P-Dimers (blau). c) CSPs, die durch irreversible Deamidierung von N373 herrühren. Gestrichelte Linien zeigen die 2s Linie (rote Balken) und die experimentell ermittelte Nachweisgrenze von 7.9 Hz (orangene Balken) an. d) Abbildung der CSPs auf der Kristallstruktur des P-Dimers, das mit B Trisaccharid (pdb: 4X06) komplexiert ist. Modifizierte Abbildung aus [1].
  • Abb. 2: Links: Selektive Deamidierung von Asn373 zu isoAsp373. Rechts: Loop-Konformationen, die das Deamidierungsmotif enthalten. a) VA387 (gelb, PDB 2obt), b) CHDC2094 1974 (blau, PDB 5iyq), c) NL 2004 (orange, PDB 3sld), d) Farmington Hills 2004 (pink, PDB 4oov), e) Kumamoto 2006 (hellgrün, PDB 4oox) and f) Saga 2006 (türkis, PDB 4wzl). Asp 374 ist in allen mit gezeigt. Die rasche und selektive Deamidierung verlangt offenbar die Einbettung in die gezeigte Loopkonformation. Modifizierte Abbildung aus [1].
Humane Noroviren gelten als Hauptverursacher viraler Gastroenteritis, doch gibt es derzeit weder einen Impfstoff noch einen antiviralen Wirkstoff. Wir untersuchen in unserem Labor daher die ersten Schritte der Infektion - die Wechselwirkung der Viren mit sogenannten Histoblutgruppenantigen (HBGAs) - auf molekularer Ebene mit Hilfe der hochauflösenden NMR-Spektroskopie. Dabei zeigt es sich, dass eine posttranslationale Modifikation des Proteinrückgrats in der HBGA-Bindungsstelle diese für die Infektion essentiellen Wechselwirkungen weitgehend unterbindet [1].
 
Die Bindung humaner Noroviren an Histoblutgruppenantigene ist essentiell für die Infektion
Durch Norovirusinfektionen kommt es weltweit jedes Jahr zu 50.000 Todesfällen unter Kindern, hauptsächlich in Schwellenländern. Der geschätzte ökonomische Schaden durch Produktionsverlust und Krankenversorgungskosten ist mit jährlich 60 Milliarden US-$ erheblich (National Center for Immunization and Respiratory Diseases, Division of Viral Diseases, Juni 2018). Dennoch gibt es derzeit weder einen Impfstoff noch einen antiviralen Wirkstoff. In unserem Labor beschäftigen wir uns mit den ersten Schritten des Infektionsprozesses, der Anheftung der Viren an sogenannte Histoblutgruppenantigene (HBGAs). Es ist zwar bekannt, dass HBGAs für die Infektion mit humanen Noroviren essentiell sind, doch der zugrunde liegende Mechanismus ist bisher weitgehend ungeklärt [2]. Ein Ziel unserer Untersuchungen ist die Entwicklung potenter antiviraler Entry-Inhibitoren auf der Basis der hochkonservierten HBGA-Erkennung. Dabei gibt es verschiedene Ansätze, wobei die Ausnutzung multivalenter Bindung sehr vielversprechend erscheint [3]. Doch bevor diese Ansätze weiterverfolgt werden können, müssen die molekularen Grundlagen der spezifischen HBGA-Bindung durch humane Noroviren geklärt sein.
 
Kristallographische Arbeiten sind die Grundlage der NMR-Untersuchungen
Aus kristallographischen Studien war die HBGA-Bindungsstelle mit atomarer Auflösung bekannt [4], doch gab es erhebliche Schwankungen bei der Bestimmung der Affinitäten viraler Hüllproteine für HBGAs, die sich nicht erklären ließen.

Auch wurden scheinbar kooperative Effekte bei der HBGA-Bindung beobachtet [5]. Um diesen Widersprüchen auf den Grund zu gehen, haben wir die Norovirus Hüllproteine NMR-spektroskopischen Untersuchungen unterzogen [1], die auf der Beobachtung von Protein-NMR Spektren und insbesondere deren „Störungen“ (chemische Verschiebungsperturbationen) [6] bei Ligandenbindung beruhen. Für die HBGA-Erkennung ist die sogenannte P-Domäne des VP1-Kapsidproteins verantwortlich [7]. Wir haben diese P-Domäne rekombinant hergestellt und dabei mit NMR-aktiven Isotopen angereichert, um so zu einer Zuordnung der Rückgrat NH-Signale des Proteins zu gelangen. Auf der Basis dieser Zuordnung ist die Untersuchung der Bindung von HBGAs und anderen Liganden unter physiologischen Bedingungen mit Hilfe chemischer Verschiebungsperturbationen (Chemical Shift Perturbations, CSPs) möglich. CSPs lassen weitreichende Rückschlüsse darüber zu, welche Aminosäuren in die Bindung direkt oder indirekt (allosterisch) involviert sind, und erlauben eine detaillierte Analyse der Bindungsaffinitäten [1]. Insbesondere im Bereich niedriger Affinitäten, die durch Dissoziationskonstanten im hohen mikromolaren bis in den millimolaren Bereich gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von CSP-Titrationen zur Ermittlung von Bindungsaffinitäten als Goldstandard anzusehen.

 
NMR-Experimente mit viralen Kapsidproteinen enthüllen eine spontane posttranslationale Modifikation des Proteinrückgrats
Die Größe des Proteins, das als Dimer mit einem Molekulargewicht von ca. 70 kDa anfällt, erwies sich bei der Analyse der Proteinrückgrat NH-Signale als erhebliche Herausforderung, die aber schlussendlich mit einer ca. 90% vollständigen Zuordnung sehr zufriedenstellend bewältigt werden konnte. Mit dieser Zuordnung war es nun möglich, mit Hilfe zweidimensionaler NMR-Korrelationsexperimente, sogenannter 1H,15N TROSY HSQC Experimente, die Bindung von HBGAs durch chemische Verschiebungsperturbation genau zu untersuchen. Das zweidimensionale NMR-Spektrum dient dabei als Fingerabdruck des Proteins, wobei jedes Kreuzsignal für das Rückgrat-NH einer Aminosäure steht. Zu unserer Überraschung zeigten sich in diesen HSQC-Spektren auch ohne Zugabe von HBGAs oder anderen Liganden mit der Zeit erhebliche irreversible Veränderungen. Während die Mehrzahl der Kreuzsignale unverändert blieb, entstand ein neuer Satz von Signalen, während andere Signale verschwanden (Abb. 1).
Aufgrund der Irreversibilität des Vorgangs konnten Konformationsänderungen als Ursache ausgeschlossen werden. Es ist bekannt, dass die Eigenschaften von Proteinen durch spontane posttranslationale Modifikationen des Rückgrats moduliert werden. Dies hat etwa bei der rekombinanten Herstellung therapeutischer monoklonaler Antikörper größere Beachtung gefunden, da derartige Veränderungen in der Antigenbindungsstelle unerwünscht sind. Eine häufig auftretende Rückgrat-Modifikation ist die spontane Deamidierung von Asparaginresten. Es entstehen auf diese Weise generell Aspartat- oder Isoaspartatreste. Insbesondere die Bildung eines Isoaspartatrestes beeinflusst die lokale Konformation des Proteins an dieser Stelle, da eine sogenannte Isopeptidbindung entsteht (Abb. 2).
Es setzt sich zunehmend die Erkenntnis durch, dass spontane Deamidierungen von Asparaginresten bei der Steuerung verschiedenster biologischer Prozesse eine Rolle spielen, doch ist der analytische Nachweis einer solchen Modifikation nicht trivial. Die NMR-Spektroskopie erlaubt einen direkten Nachweis einer solchen punktuellen posttranslationalen Modifikation auch in großen Proteinen, was allerdings die Verfügbarkeit einer 2H,13C,15N dreifach isotopenangereicherten Probe voraussetzt. Im Zuge unserer Zuordnungsexperimente lieferte das sogenannte 3D HN(CO)CACB-Spektrum die entscheidende Information (Abb. 1), die eine selektive und vergleichsweise schnelle Umwandlung des Asn373 in isoAsp373 (Halbwertszeit t1/2 ca. 1.5 Tage bei 37°C) anzeigte. Sichtbar wird diese Umwandlung anhand eines Phasenwechsels in den entsprechenden Spuren eines speziellen 3D NMR Experimentes. Dadurch wird eindeutig das Vorhandensein einer Isopeptidbindung an dieser Stelle angezeigt. Die NMR-Ergebnisse konnten weiterhin massenspektrometrisch gestützt werden.
 
Die spontane Umwandlung von Asn373 in isoAsp373 hat Konsequenzen
Der Vergleich von Aminosäuresequenzen der derzeit in Epidemien vorherrschenden GII.4 Norovirusstämme offenbart, dass das Sequenzmotiv, das zu der recht schnellen Deamidierung führt, in ca. 66% der Sequenzen zu finden ist. Interessant ist nun, dass die Deamidierung von Asn373 in unmittelbarer Nachbarschaft zu Asp374 stattfindet und ausschließlich zu einem isoAspartatrest führt (Abb. 2). Asp374 ist für die Erkennung von HBGAs essentiell und daher zu 100% konserviert. Viren mit Mutationen an dieser Stelle können nicht mehr an HBGAs binden. Die spontane Deamidierung von Asn373 und die damit verbundene Bildung einer Isopeptidbindung an dieser Stelle führt ebenfalls zu einem nahezu kompletten Verlust der HBGA-Bindung, der sich durch Erhöhung der Dissoziationskonstante um eine Größenordnung bemerkbar macht [1]. Die Identifizierung dieser spontanen Deamidierung und die damit verbundene signifikante Reduktion der HBGA-Affinität lässt zumindest zu einem Teil die Widersprüche in den bisherigen Affinitätsmessungen verstehen, da in Unkenntnis der unter physiologischen Bedingungen raschen Deamidierung inhomogene Proben vorlagen, die je nach Temperatur, Lagerungszeiten und Dauer der Experimente schwankende Ergebnisse liefern mussten. Durch CSP-Titrationsexperimente mit frisch gereinigten Proben bei niedrigen Temperaturen, bei denen die Deamidierung sehr langsam verläuft, konnten wir nun erstmals verlässliche Dissoziationskonstanten bestimmen. Für das kleinste Fragment, das von den viralen Hüllproteinen gebunden wird, die L-Fucose, haben wir einen KD-Wert von 22 mM ermittelt. Für das Blutgruppe B-Trisaccharid ergibt sich ein Wert von ca. 5 mM [1]. Diese Dissoziationskonstanten sind etwa um eine Größenordnung höher als zuvor ermittelte Werte und auch die vermutete Kooperativität bei der Bindung von HBGAs kann nun ausgeschlossen werden. Wir haben mittlerweile systematisch eine ganze Reihe von HBGAs untersucht und konnten diese ersten Ergebnisse voll und ganz bestätigen.
 
Ausblick
Die Erkenntnis, dass das Kapsidprotein VP1 in human Noroviren einer spontanen Deamidierung unterliegt, die die HBGA-Erkennung erheblich moduliert, hat Konsequenzen. So muss beispielsweise bei der Suche nach Entry-Inhibitoren darauf geachtet werden, dass tatsächlich die nicht deamidierte Form als Target vorliegt. Genauso muss diese Modifikation bei der Entwicklung von Impfstoffen beachtet werden, da Asn373 Teil des sogenannten A-Epitops ist [8], das von Antikörpern erkannt wird. Welchen Vorteil die Modifikation dem Virus bei der Infektion verschaffen könnte, wird in der Zukunft zu klären sein.
 
Danksagungen
Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Unterstützung des Projekts im Rahmen der Forschergruppe ViroCarb (FOR2327, DFG Pe494/12-1, DFG Pe494/12-2).
 
 

Autoren
Robert Creutznacher1, Thomas Peters1, Alvaro Mallagaray1

Zugehörigkeit
1Institut für Chemie und Metabolomics, Universität zu Lübeck, Deutschland
 

Kontakt
Prof. Dr. Thomas Peters

Institut für Chemie und Metabolomics
Universität zu Lübeck
Lübeck, Deutschland
thomas.peters@uni-luebeck.de
 

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Literatur

[1] A. Mallagaray, R. Creutznacher, J. Dülfer, P. H. O. Mayer, L. L. Grimm, J. M. Orduna, E. Trabjerg, T. Stehle, K. D. Rand, B. S. Blaum, C. Uetrecht, T. Peters, A post-translational modification of human Norovirus capsid protein attenuates glycan binding, Nature communications 2019, 10, 1320.
doi:10.1038/s41467-019-09251-5.
[2] a) S. M. Karst, S. Zhu, I. G. Goodfellow, J Pathol 2015, 235, 206-216; b) S. M. Karst, C. E. Wobus, PLoS Pathog 2015, 11, e1004626.
[3] a) K. S. Bücher, H. Yan, R. Creutznacher, K. Ruoff, A. Mallagaray, A. Grafmuller, J. S. Dirks, T. Kilic, S. Weickert, A. Rubailo, M. Drescher, S. Schmidt, G. Hansman, T. Peters, C. Uetrecht, L. Hartmann, Biomacromolecules 2018, 19, 3714-3724; b) C. Rademacher, J. Guiard, P. I. Kitov, B. Fiege, K. P. Dalton, F. Parra, D. R. Bundle, T. Peters, Chemistry 2011, 17, 7442-7453.
[4] a) B. K. Singh, M. M. Leuthold, G. S. Hansman, J Virol 2015, 89, 2024-2040; b) S. Cao, Z. Lou, M. Tan, Y. Chen, Y. Liu, Z. Zhang, X. C. Zhang, X. Jiang, X. Li, Z. Rao, J Virol 2007, 81, 5949-5957.
[5] A. Mallagaray, J. Lockhauserbäumer, G. S. Hansman, C. Uetrecht, T. Peters, Angew Chem Int Ed 2015, 54, 12014-12019.
[6] M. P. Williamson, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 2013, 73, 1-16.
[7] M. Tan, R. S. Hegde, X. Jiang, J Virol 2004, 78, 6233-6242.
[8] L. C. Lindesmith, M. L. Mallory, K. Debbink, E. F. Donaldson, P. D. Brewer-Jensen, E. W. Swann, T. P. Sheahan, R. L. Graham, M. Beltramello, D. Corti, A. Lanzavecchia, R. S. Baric, Conformational Occlusion of Blockade Antibody Epitopes, a Novel Mechanism of GII.4 Human Norovirus Immune Evasion, mSphere 2018, 3.
DOI: 10.1128/mSphere.00518-17

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