Einfluss der Dreidimensionalität von Substraten auf die Zellkultur

Analyse und Visualisierung

  • Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie Molekülen der Extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1 D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie Molekülen der Extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1 D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).
  • Abb. 1: Spezifische Zellantworten werden durch eine Vielzahl an verschiedenen Parametern beeinflusst. Neben biochemischen Faktoren (wie Molekülen der Extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren) gehören hierzu auch physikalische Parameter (wie Kräfte, Topographie und Anordnung von Liganden innerhalb eines Gewebes) und die Substratdimensionalität (0D = ein einzelner Punkt, 1 D = eine einfache gerade Linie, 2D = ein Schachbrettmuster, 3D = z.B. eine dreidimensionale Radstruktur).
  • Abb. 2: Direct Laser Writing (DLW) erlaubt die Herstellung von unterschiedlichen, geometrisch genau definierten 3D Strukturen wie z.B. (a) Gitterstrukturen, (b) Dreiecken, und (c) Stufensystemen. In diesen 3D Strukturen können Zellen kultiviert werden (d-f) (blau = Nukleus, grün = F-Aktin, rot bzw. violett = Fibronektin). (Modifiziert nach [6,7], Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduced with permission)
  • Abb. 3: Bei vielen Mikroskoptechniken ist die axiale Auflösung schlechter als die laterale.  Daher ist das aufgelöste fokale Volumen (a) keine Kugel sondern ein Ellipsoid. Neue Methoden wie STED, SIM, STORM und PALM können das Volumen jedoch deutlich reduzieren. (modifiziert nach [8]). Mit SIM ist es möglich auch ausgedehnte 3D Rekonstruktionen zu erstellen (b). Eine Zelle spannt sich mit ihrem Aktinskelett (grün, transparent) in einer 3D Struktur auf. Kontaktpunkte sind selektiv mit Fibronektin beschichtet (rot, Oberflächenrekonstruktion). Der Kern ist in blau (DAPI) dargestellt. Lichtblattmikroskopie (SPIM) vereint gute zeitliche Auflösung mit extrem geringer Anregungsenergie (c). Dafür wird von einem Objektiv eine Lichtblattbeleuchtung erzeugt. Der zur Fluoreszenz angeregte Teil der Probe wird komplett von einem um 90° versetzten zweiten Objektiv detektiert (modifiziert nach [10]).

Unser heutiges Wissen über zellbiologische Prozesse basiert meist auf traditionellen Standardzellkulturtechniken mit planaren, zweidimensionalen (2D) Plastik- oder Glassubstraten. Betrachtet man Zellen allerdings in ihrer natürlichen Umgebung, so wachsen diese meist in einem dreidimensionalen (3D) Verbund wie z.B. in Geweben. 2D Zellkultursubstrate spiegeln somit nur unzureichend die natürlichen Wachstumsbedingungen von tierischen Zellen im Organismus wider. Dementsprechend sollten unsere bisherigen Erkenntnisse über zellbiologische Prozesse, die unter wenig physiologischen 2D Kulturbedingungen gewonnen wurden, zukünftig durch Studien unter physiologisch realeren 3D Kulturbedingungen komplementiert bzw. richtig gestellt werden. Neuartige mikroskopische Techniken bieten dabei die Möglichkeit zelluläre Details auch in 3D Substraten um Größenordnungen besser aufzulösen.
Zellkultur und Mikroskopie in der zweiten Dimension

Im Allgemeinen ist das Untersuchen von Zellverhalten auf 2D Substraten, und in Gegenwart von biochemischen bzw. physikalischen Faktoren, mittlerweile eine gut etablierte und erfolgreiche Methode in der zellbiologischen Forschung. Zahlreiche mikroskopische Techniken haben hier dazu beigetragen, wobei die Fluoreszenzmikroskopie besonders hervorzuheben ist. Selbst bei 2D Substraten ist dabei die Möglichkeit optische Schnitte zu erzeugen, d.h. die Fluoreszenz außerhalb der Fokusebene zu blocken, von großer Bedeutung. Aus diesem Grund ist unter anderem die konfokale Laserscanningmikroskopie weit verbreitet und etabliert. Allerdings sind weitere Untersuchungen, wie die zahlreichen existierenden chemischen, sowie physikalischen Stimuli gleichzeitig eine spezifische Zellantwort auslösen können (Abb. 1), aufgrund der eingeschränkten aktuellen experimentellen Modelle limitiert. Diese sind jedoch besonders wichtig, da während der letzten Dekade deutlich wurde, dass neben biochemischen Faktoren wie z. B. Adhäsionsmolekülen, auch die physikalischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (EZM) einen entscheidenden Einfluss auf das Zellverhalten, wie beispielsweise auf die Zelldifferenzierung, haben [1,2,3].

Die physikalischen Eigenschaften der zellulären Umgebung beinhalten hierbei unter anderem die mechanische Steifigkeit, die Topographie und die räumliche Anordnung bestimmter Liganden (Abb. 1). Studien mit 2D nano- und mikrostrukturierten Oberflächen haben gezeigt, dass die räumliche Verteilung der Liganden einen deutlichen Einfluss auf verschiedene, physiologische Prozesse, wie z. B. auf die Zellvitalität und Zellproliferation, hat. Zusätzlich zur geometrischen Anordnung der Liganden, spielt auch die Steifigkeit des 2D Zellsubstrates eine wichtige Rolle bei der Regulation von allgemeinem Zellverhalten. Es wurde gezeigt, dass sich die Organisation von Zellen stark verändert, sobald diese auf weichen 2D Substraten kultiviert werden.

Zellkultur in der dritten Dimension
Vergleicht man Zellen, die auf einer 2D Oberfläche kultiviert werden, mit Zellen in einer physiologischen 3D Umgebung, so variieren diese deutlich in ihrer Morphologie, in der Ausbildung ihrer Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, sowie im Grad ihrer Differenzierung. Mittlerweile wurden zahlreiche Studien durchgeführt, um den Einfluss der 3D Umgebung auf das Verhalten verschiedenster Zelltypen zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Kultivierung von Zellen auf 2D vs. 3D Substraten einen entscheidenden Einfluss auf das Zellverhalten nimmt. Zellen, die in einer zellkultursezernierten 3D EZM Umgebung kultiviert werden, weisen eine elongierte, spindelförmige Morphologie auf. Auch das Migrationsverhalten, die Proliferation und die Fibrillogenese unterscheiden sich im Vergleich zu Zellen in einer 2D Kulturumgebung. Für die mikroskopische Auswertung solcher 3D Substrate stellen sich jedoch mehrere Probleme. Zum einen ist die axiale Auflösung meist schlechter als die laterale, zum anderen erschweren die optischen Eigenschaften der 3D Substrate selbst die Mikroskopie: Autofluoreszenz erhöht den Hintergrund und verschlechtert das Signal-Rausch-Verhältnis, Absorption verringert das Fluoreszenzsignal der Zelle und abweichende Brechungsindizes führen zu fehlerhaften 3D Rekonstruktionen. Diese Probleme werden umso gravierender bei Lebendzellbeobachtungen, da man mit geringerer Anregungsintensität und kürzeren Belichtungszeiten mikroskopieren muss, was zu einem schlechteren Signal-Rausch-Verhältnis führt. Wie schon erwähnt, beeinflusst nicht nur die chemische Zusammensetzung der Oberfläche, sondern auch die Topographie entscheidend das Zellverhalten. Die Kontrolle der mechanischen Eigenschaften einer 3D Umgebung ist ebenfalls von Bedeutung. Hierbei stehen insbesondere poröse Materialien im Fokus (z.B. PMMA), da diese die Herstellung künstlicher, biomimetischer Gewebe erlauben. Bisherige Studien in 3D Substraten wurden an einer Vielzahl verschiedenster Zelltypen getestet. Neben Vitalitätstests wurden hierbei auch Tests zur Zytotoxizität der verwendeten Materialien durchgeführt. Insgesamt zeigte sich, dass die meisten (synthetischen) Polymere eine geringe Zytotoxizität aufweisen und eine Proliferation der Zellen begünstigen. Außerdem wurde der Einfluss der 3D Zellsubstrate auf die Differenzierung von Stammzellen in Fett-, Knochen-, und Knorpelzellen untersucht [4]. In Zukunft könnten spezifische 3D Zellkultursubstrate hilfreich sein, um Stammzellnischen erfolgreich nachzubilden und somit die Differenzierung gezielt zu kontrollieren. Hierzu muss der Fokus verstärkt auf Einzelzellstudien gelegt werden, um zellspezifische Verhaltensweisen wie z. B. die Morphologie, Form, Adhäsion und Migration von Zellen besser im Detail untersuchen zu können. In bisherigen 3D Studien wurde meist mit einer hohen Anzahl an Einzelzellen oder Zellagglomeraten gearbeitet, die oft nur eine „Ja-Nein"-Antwort, z. B. in Bezug auf die Zelladhäsion oder Zellvitalität, erlauben. Spezifische Einzelzellantworten waren damit aber bis dato nicht möglich.

Neuartige 3D Substrate
Obwohl in den letzten Jahren eine Vielzahl an 3D Studien unser Verständnis hinsichtlich zellbiologischer Prozesse erweitert haben, gilt es noch immer einige Probleme zu lösen. Bisher waren 3D Umgebungen schwierig zu kontrollieren und bezüglich ihrer Geometrie oft unzureichend definiert. Auch ihre chemische Zusammensetzung und ihre mechanischen Eigenschaften ließen sich nur schwer steuern. Betrachtet man z.B. zellkultursezernierte 3D Umgebungen, so weisen diese zwar eine starke Ähnlichkeit zur in vivo Situation auf, sind jedoch in ihrer Komplexität unkalkulierbar. Andere etablierte, künstliche 3D Systeme wie synthetische Hydrogele oder mikrostrukturierte, adhäsive Oberflächen erlauben zwar eine Nachbildung der porösen EZM und sind in ihrer geometrischen Form kontrollierbar, lassen sich allerdings nicht völlig flexibel gestalten. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Entwicklung von neuartigen 3D Zellkultursubstraten mit diversen chemischen Funktionalisierungsmethoden weiter voranzutreiben. Um die Lücke zwischen einer komplexen, natürlichen in vivo Situation und einer stark vereinfachten in vitro Situationen zu schließen, haben wir 3D Mikrostrukturen entwickelt, die eine systematische Untersuchung von klar definierten Parametern wie Dreidimensionalität, Substratsteifigkeit und biochemische Zusammensetzung auf das Zellverhalten ermöglichen. Die Herstellung dieser definierten 3D Mikrostrukturen erfolgt mit Hilfe der Zwei-Photonen-Polymerisation durch Direct Laser Writing (DLW). In unserem Labor werden unter anderem bio-funktionalisierte 3D Zellkultursubstrate mit variierender Geometrie gefertigt, um Zell-Matrix-Adhäsionen zu untersuchen [5,6,7] (Abb. 2). In natürlichen Geweben wirken außerdem immer auch mechanische Kräfte wie Kompression, Dehnung und Scherkräfte auf die Zellen ein. Umgekehrt generieren aber auch Zellen selbst Kontraktionskräfte und modellieren somit ihre 3D Umgebung. Es ist wichtig die Wechselwirkung von Zellen und Kräften in 3D aufzuklären, um solch elementare Prozesse wie z.B. die Gewebedifferenzierung verstehen zu können. Auch in pathologischer Hinsicht könnte man hierdurch Fortschritte erzielen und neue Therapieansätze erstellen, da mechanische Aspekte mit unterschiedlichen Krankheiten wie z.B. Asthma oder Krebs assoziiert werden.

Hochauflösende Mikroskopie - Neue Möglichkeiten für die Analyse von 3D Substraten
Seit Ernst Abbe aus der Wellennatur des Lichts seine Gleichung für die mikroskopische Auflösung herleitete, war die Auflösungsgrenze als Naturgesetz akzeptiert. Danach kann ein Lichtmikroskop - selbst mit den besten Objektiven von heute - allenfalls eine laterale Auflösung von 200 nm aufweisen. Aus einer ähnlichen Herleitung ergibt sich in axialer Richtung eine schlechtere Auflösung von 500 nm. In den letzten Jahren hat sich allerdings durch die Arbeiten mehrerer unabhängiger Gruppen gezeigt, dass die Auflösungsgrenze nicht unüberwindbar ist. Unter der Vielzahl der neuen Techniken sind vor allem STED, STORM, PALM und SIM als Abkürzungen für die bekanntesten Varianten zu erwähnen [8]. Für die 3D Mikroskopie weisen allerdings nicht alle Methoden Verbesserungen auf. Betrachtet man das kleinste aufgelöste Volumen, das Voxel (Abb. 3), stellt man fest, dass STED die Auflösung nur in lateraler Richtung verbessert. STORM und PALM verbessern grundsätzlich auch nur die laterale Auflösung. Für eine gute axiale Auflösung sind sie auf eine Kombination mit anderen Techniken angewiesen, die entweder sehr aufwendig im Aufbau oder auf Mikroskopie an der Glas-Zelle-Grenze limitiert sind. Im Vergleich zu diesen Methoden zeigt SIM nur eine moderate Verbesserung mit einer Auflösungsgrenze 100 nm in lateraler und 250 nm in axialer Richtung. Betrachtet man allerdings den Voxel (Abb. 3) wird klar, dass SIM für 3D Mikroskopie wichtig ist. Für 3D Zellkulturanalysen ist dabei von besonders großer Bedeutung, dass SIM auch in der Lage ist verhältnismäßig tief in Proben zu arbeiten und ausgedehnte 3D Rekonstruktionen zu erstellen (Abb. 3).

Neben den genannten Techniken gibt es mit der sogenannten Lichtblattmikroskopie (SPIM) [9] eine besonders vielversprechende Technik für 3D Substrate. Dabei wird die Probe von einem Objektiv mit einem Lichtblatt oder -vorhang beleuchtet. Die erzeugte Fluoreszenz wird dagegen von einem um 90 ° versetzten, zweiten Objektiv detektiert. Dadurch wird exakt der Teil der Probe zur Fluoreszenz angeregt, der auch detektiert wird. Dies ermöglicht eine um Größenordnungen reduzierte Anregungsenergie. Durch drehen der Probe ist es außerdem möglich eine stark verbesserte Auflösung in axialer Richtung zu erreichen. In der neuesten Variante [10] kombiniert SPIM die Lichtblattbeleuchtung mit den genannten Vorteilen der strukturierten Beleuchtung von SIM. Damit erscheint diese Technik hervorragend geeignet für zukünftige Einzelzellstudien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in 3D Substraten.

Ausblick
Während der letzten Jahre konnten durch eine verstärkte interdisziplinäre Forschung signifikante Fortschritte in der Herstellung neuer 3D Zellkultursubstraten erzielt werden. Nichtsdestotrotz sind die Herstellungstechniken und -materialien, die für eine wirklichkeitsgetreue Nachbildung von 3D Substraten geeignet wären, noch weitestgehend limitiert. Die Kombination verschiedenster Materialien und deren präzise, geometrische Kontrolle stellen ein großes Potential bei der Entwicklung von 3D Zellkultursubstraten dar. Sie können uns zukünftig helfen, ein tieferes Verständnis über zellbiologische Prozesse zu erlangen, ohne dabei die Wirkung geometrischer, mechanischer und biochemischer Signale außer Acht zu lassen. Neue Entwicklungen auf dem Gebiet der Mikroskopie ermöglichen dabei eine genauere Untersuchung, als es noch vor kurzem möglich schien. Dies wird uns einerseits ein detaillierteres Verständnis über physiologische Prozesse liefern, andererseits aber auch neue Möglichkeiten bei der Erstellung von Therapieansätzen und in der regenerativen Medizin bieten.

Referenzen
[1] Frantz C. et al.: J Cell Sci 123, 4195-4200 (2010)
[2] Dufort C.C. et al.: Nat Rev Mol Cell Biol 12, 308-319 (2011)
[3] Ross A.M. et al.: Small 8, 336-355 (2012)
[4] Kumar G. et al.: Biomaterials 32, 9188-9196 (2011)
[5] Klein F. et al.: Advanced Materials 22, 868-871 (2010)
[6] Klein F. et al.: Advanced Materials 23, 1341-1345 (2011)
[7] Greiner A.M. et al.: Macromol Biosci 12: 1301-1314 (2012)
[8] Schermelleh L. et al.: J Cell Biol 190: 165-175 (2010)
[9] Keller PJ: Science 340: 1234168 (2013)
[10] Gao L. et al.: Cell 151: 1370-85 (2012)

http://bit.ly/3DZellkultursubstrate
Weitere Beiträge zum Thema: http://bit.ly/Zellkultur

Lebenslauf: Dr. Alexandra M. Greiner
Alexandra M. Greiner ist seit 2010 wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Zoologie am KIT, Karlsruhe. Sie studierte Biologie an der RWTH Aachen und der Lund Universität (Schweden). Ihre Doktorarbeit hat sie am MPI für Metallforschung in Stuttgart und der Universität Manchester (UK) durchgeführt. 2009 erhielt sie ihren Doktorgrad von der Universität Heidelberg. Ihre Forschungsinteressen liegen beim Einfluss von physikalischen und chemischen Substratparametern auf zelluläre Systeme.

Lebenslauf: Michael Bachmann
Michael Bachmann ist seit 2011 Doktorand am Institut für Zoologie am KIT, Karlsruhe, und ist Stipendiat der Karlsruhe School of Optics and Photonics (KSOP). Er hat Biologie und Physik am KIT studiert und beschäftigt sich in seiner Doktorarbeit vor allem mit hochauflösenden Mikroskopietechniken und Methoden für die selektive Oberflächenstrukturierung für Zellmigrationsstudien.

Lebenslauf: Prof. Dr. Martin Bastmeyer
Martin Bastmeyer ist seit 2004 Professor für Zell- und Neurobiologie am KIT. Er erhielt seinen Doktor in Biologie von der Universität Kaiserslautern. Anschließend arbeitete er am MPI in Tübingen, am Salk Institute in San Diego und an der Universität Konstanz. Er erhielt 1998 ein Heisenberg Stipendium und war von 2001-2004 Professor in Jena. Seine Forschung umfasst u. a. die Entwicklung des Nervensystems, Zellmechanik, Zellwachstum in 3D und neue Lichtmikroskopietechniken.

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