Einsatz im Knochen Tissue Engineering: Testung neuartiger Glaskeramiken

  • Abb. 1: REM-Aufnahmen der Glaskeramik Osseolive, Beschreibung siehe TextAbb. 1: REM-Aufnahmen der Glaskeramik Osseolive, Beschreibung siehe Text
  • Abb. 1: REM-Aufnahmen der Glaskeramik Osseolive, Beschreibung siehe Text
  • Abb. 2: REM-Aufnahmen von ucMSC nach 5-wöchiger Expansion (a, b) und DAPI-Färbung (Oberseite des Biomaterials) der Differenzierungsproben , ucMSC (c), adMSC (d)
  • Abb. 3: (a) Viabilität der MSC auf der Glaskeramik nach 5-wöchiger Expansion
  • Abb. 3: (b) akkumulierter Glukoseverbrauch/Laktatproduktion der Differenzierungsproben
  • Abb. 4: REM-Aufnahmen der Differenzierungsproben von ucMSC (a, b), Calcein-Färbung von ucMSC (c), adMSC (d) und Blindprobe
  • Abb. 4: ohne Zelle (e)

Im Knochen Tissue Engineering (TE) kommen häufig bioaktive Keramiken zum Einsatz, da sie die Bildung von neuem Knochen stark fördern und leicht mit dem Gewebe verwachsen. In dieser Studie wurde die Proliferation und osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen auf Glaskeramik untersucht.

Die Viabilität der Zellen konnte über einen Kultivierungszeitraum von 5 Wochen nachgewiesen werden. Mittels REM-Aufnahmen und spezifischer histologischer Färbungen konnten Calciumphosphat-Einlagerungen in der extrazellulären Matrix (EZM) beobachtet werden, was auf die osteogene Differenzierung der Zellen hindeutet. Die Ergebnisse zeigen insgesamt, dass die hier verwendete Glaskeramik als Trägermaterial potentiell für den Einsatz im Knochen TE geeignet ist.

Einleitung

Knochen ist ein spezialisiertes Gewebe, welches die Kapazität zur Selbstheilung besitzt. Dennoch leiden jährlich weltweit ca. 2,2 Mio. Patienten an Knochendefekten, die ohne eine Transplantation nicht heilen [1]. Eine Alternative zu auto- und allogenen Transplantaten ist die Züchtung von künstlichem Gewebe, das sogenannte Tissue Engineering (TE).

Das TE nutzt zur Herstellung eines Transplantats die Kombination aus Biomaterialien und Zellen. Dabei spielt sowohl der Zelltyp, als auch die Auswahl des Biomaterials eine entscheidende Rolle.Im Allgemeinen sollte das Biomaterial für Knochen TE folgende Anforderungen erfüllen: Es sollte biokompatibel, biodegradierbar und sterilisierbar sein, eine 3D hochporöse und interkonnektierte Architektur aufweisen, mechanisch stabil sein und die Oberfläche sollte die Zelladhäsion, Proliferation und Differenzierung fördern.

Geeignet sind unter anderem bioaktive Glaskeramiken, basierend auf anorganischen Silicaten und Phosphaten [2]. Diese Trägermaterialien zeigen ein Knochenwachstum stimulierendes Verhalten und fördern die Ausbildung einer carbonathaltigen Hydroxylapatitschicht, die eine starke Bindung zwischen Matrix und menschlichem Knochengewebe gewährleistet [2].

Methoden

Die verwendete Glaskeramik Osseolive der Firma Curasan besteht aus einem Silicium-dotierten Calciumkaliumnatriumphosphat [3].

Die Materialien wurden mittels Schlickertechnik und offenzelligen PU-Schäumen für diesen Versuch hergestellt. Bei der Herstellung dünnerer zylindrischer Formkörper (hier: 10 x 3 mm) ist die Erhaltung eines interkonnektierten, offenzelligen Netzwerks nicht immer gewährleistet.

Die Porengröße beträgt etwa 500 μm. Zur Sterilisation wurde das Material autoklaviert. Die verwendeten ucMSC (mesenchymale Stammzellen) wurden aus humaner Nabelschnur isoliert. Die Isolation wurde mit der Explant- Methode nach Protokollen unsere Arbeitsgruppe durchgeführt [4]. AdMSC (aus humanem Fettgewebe  5]) wurden vom österreichischen Roten Kreuz zur Verfügung gestellt.

Nach der Expansion der ucMSC und adMSC in Kulturmedium (αMEM, 5 % humanes Serum, 50 μg/ml Gentamycin) werden die Zellen mit Accutase abgelöst und eine Suspension (6 x 104 Zellen/50 μl) auf die Oberseite jeder Matrix aufgebracht. Nach einer Woche Kultivierung werden die Proben zur Expansion und Differenzierung unterteilt. Für die weitere Expansion über 4 Wochen wird Kulturmedium verwendet.

Für die osteogene Differenzierung werden die Proben in osteogenem Differenzierungsmedium (Miltenyi Biotec) kultiviert. Das Medium wird an Tag 1, 3 und 5 jeder Versuchswoche gewechselt. Die Stoffwechselaktivität der Differenzierungsproben wird über den Glukoseverbrauch/ Lakatproduktion ermittelt.

Die Viabilität der MSC wird in den Expansionsversuchen mittels MTT-Tests bestimmt. Rasterelektronenmikroskopische (REM)-Aufnahmen werden mit einem Jeol JSM-6700F durchgeführt. Die histologischen Färbungen mit dem Fluorophoren 4’,6-Diamidino- 2-phenylindol (DAPI) und Calcein werden nach Protokollen des Herstellers Sigma ausgeführt.

Ergebnisse

Mittels REM-Aufnahmen wurde festgestellt, dass das Biomaterial herstellungsbedingt nicht vollständig interkonnektiert ist. Die Matrix weist häufig keine Poren, sondern Vertiefungen auf (Abb. 1a, Poren mit Pfeilen gekennzeichnet). Allerdings weist die Oberfläche des Biomaterials eine sehr unebene Struktur auf (Abb. 1b). Eine raue Oberfläche begünstigt die Adhäsion von Zellen.

Die MSC sind nach 5 Wochen Expansion gleichmäßig auf der Matrix verteilt. Sowohl ucMSC, als auch adMSC haben viel EZM gebildet. Der entstandene Zellrasen verschließt die Poren (Abb. 2a). Die MSC weisen eine flache, und glatte Morphologie auf, was auf eine starke Adhäsion hindeutet (Abb. 2b). Die gleichmäßige Verteilung der MSC auf der Glaskeramik wurde in den Differenzierungsversuchen mittels DAPI nachgewiesen (Abb. 2 c, d).

Der Verlauf der Em/Ex-Werte über den Zeitraum von 5 Wochen weist darauf hin, dass die sich adMSC über 3–4 Wochen vermehren, bis sie sich aufgrund der limitierten Fläche von der Keramik lösen (Abb. 3a). Hingegen lösen sich die ucMSC nach 5-wöchiger Expansion nicht vom Trägermaterial ab. Sowohl beim Glukoseverbrauch, als auch bei der Lactatproduktion sind nur geringe Unterschiede zwischen der Kultivierung von ucMSC und adMSC zu erkennen.

UcMSC und adMSC weisen eine kurze Lag-Phase von ca. 5–8 Tagen auf (Abb. 3b). Die osteogene Differenzierung von MSC auf Osseolive mithilfe des Differenzierungsmediums konnte anhand von REM-Aufnahmen bestätigt werden. Im Vergleich zur EZM nach 5-wöchiger Expansion, weist die EZM der Differenzierungsproben eine sehr raue Morphologie auf (Abb. 4 a, b).

Diese Morphologie ist auf Calciumphosphat-Ablagerungen zurückzuführen, was ein deutlicher Hinweis auf die Mineralisierung der EZM ist [6]. Durch die Färbung mit Calcein konnte die Calcifizierung der EZM von ucMSC und adMSC nachgewiesen werden. Die fluoreszierenden Bereiche bestätigen die Einlagerung von Calciumionen (Abb. 4 c, d). 

Diskussion

Neben der Auswahl des geeigneten Zelltyps, spielt die Wahl der Matrix eine entscheidende Rolle für das TE. Keramiken genügen häufig den Anforderungen des Knochen TE. Osseolive ist eine Calcium basierte Glaskeramik und kann mit dem Kochengewebe verwachsen. Die Matrix besitzt eine raue Oberfläche, welche nachweislich die Adhäsion der Zellen fördert.

Diese Glaskeramik weist herstellungsbedingt keine vollständige offenzellige Interkonnektivität auf. Allerdings konnte anhand von REM-Aufnahmen und der Färbung mit DAPI gezeigt werden, dass sich dies nicht nachteilig auf die Verteilung der MSC auswirkt. Auch die Unterseite der Matrix, welche nicht direkt mit Zellen besiedelt wurde, ist nach 5 Wochen vollständig mit Zellen bedeckt (nicht gezeigt).

Folglich wachsen und wandern die MSC langsam von oben nach unten durch das Material. Für adMSC konnte eine steigende bzw. gleich bleibende Viabilität über 4 Wochen geazeigt werden; ucMSC für 5 Wochen. Die adMSC lösen sich ab Woche 4 von der Glaskeramik ab, was mikroskopisch mittels DAPI bestätigt wurde (nicht gezeigt) und durch die Ergebnisse des MTT-Test unterstützt wird.

Ursache hierfür ist die limitierte Oberfläche bei einer höheren Zellgröße der adMSC im Vergleich zu ucMSC. Die osteogene Differenzierung von sowohl ucMSC, als auch adMSC durch das Differenzierungsmedium konnte mithilfe von REM-Aufnahmen und histologischen Färbungen nachgewiesen werden.

Literatur

[1] Lewandrowski K.U.:, Biomaterials 21(8), 757–64 (2000)

[2] Rezwan K.: Biomaterials 27(18), 3413–31 (2006)

[3] Bernstein A.: J Biomed Mater Res B Appl Biomater 84(2), 452–62 (2008)

[4] Lavrentieva A.: Cell Communication and Signaling 8, 18–26 (2010)

[5] Wolbank S.: Cell Tissue Bank 8(3), 163–77 (2007)

[6] Lamers E.: Biomaterials 31(12), 3307–16 (2010)

Autoren

M.Sc. Sonja Kress, Dipl.-Chem. Anne Neumann, Universität Hannover, Institut für Technische Chemie, Hannover; Dr. Birgit Weyand, Medizinische Hochschule Hannover, Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Hannover; Dr. Wolf-Dietrich Hübner, Dr. Fabian Peters, Curasan, Kleinostheim; Prof. Cornelia Kasper, Universität für Bodenkultur, Department Biotechnologie, Wien

 

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Universität für Bodenkultur - Institut für Chemie
Muthgasse 18
1190 Wien
Austria
Telefon: +43 1 360066204

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