Einzelzellanalysen: Biologie in Hochauflösung

  • Abb. 1: FISH-Verfahren macht Genexpression sichtbar. Aus [2] mit freundlicher Genehmigung der National Academy of Sciences.Abb. 1: FISH-Verfahren macht Genexpression sichtbar. Aus [2] mit freundlicher Genehmigung der National Academy of Sciences.
  • Abb. 1: FISH-Verfahren macht Genexpression sichtbar. Aus [2] mit freundlicher Genehmigung der National Academy of Sciences.
  • Abb. 2: A) Differenzierung eines Embryos in unterschiedliche Zelltypen. Zunächst trennt sich die innere Zellmasse (ICM) von den äußeren Zellen (TE). Die inneren Zellen differenzieren im nächsten Schritt weiter zum primitiven Endoderm (PE) bzw. zu den Epiblasten (EPI). B-C) Projektion von Einzelzellmessungen in die Ebene. In C wurde die Gruppenzugehörigkeit der Zellen bei der Projektion berücksichtigt und man sieht, dass Zellen aus dem 16-cell-state (hellblau) in zwei Untergruppen zerfallen. Übernommen mit Änderungen aus [1] mit freundlicher Genehmigung von Oxford Journals.
  • Abb. 3: „Stochastic Profiling“. Für eine zufällige Auswahl an mehreren Zellen wird die gemeinsame Genexpression bestimmt.

Einzelzellanalyse: Obwohl jede Körperzelle dieselbe Gensequenz enthält, sind in jeder Zelle unterschiedliche Gene aktiv und bestimmen den Zelltyp oder das Verhalten der Zelle. Mittlerweile ist es technisch möglich Expressionsanalysen auf einzelnen Zellen zu erheben. Damit kann man zum Beispiel die weitere Entwicklung von Stammzellen bestimmen oder Krebszellen in einem sehr frühen Stadium erkennen.

Seit einigen Jahren kursiert das Schlagwort „personalisierte Medizin" in Forschung und Medien und meint eine patientenspezifische Behandlung. Man hat also erkannt, dass Menschen sehr unterschiedlich auf medizinische Wirkstoffe reagieren. Ein Hauptgrund dafür ist das menschliche Genom: eine Doppelhelix (DNA) aus Genen, die in jedem Menschen einzigartig ist und die sich in jeder einzelnen Körperzelle befindet. Zoomt man näher heran, stellt man fest, dass sich auch die Zellen eines einzigen Organismus unterscheiden. Das ist zum Beispiel der Fall, wenn bei der Zellteilung winzige Fehler passieren oder Strahlung eine Genmutation bewirkt. Meist haben die Unterschiede aber natürliche Gründe: In unterschiedlichen Zelltypen (wie Haut- oder Nervenzellen) sind unterschiedliche Gene aktiv. Nur diese werden in RNA umgeschrieben (Transkription) und dann in funktionale Proteine übersetzt (Translation). Die aktiven Gene werden exprimiert und ergeben das Expressionsmuster der Zelle.

Mehr Einblick durch weniger Zellen
In der Vergangenheit wurde Genexpression typischerweise für eine Ansammlung von Zellen bestimmt. Um verlässliche Messungen zu erhalten, bei denen technische Ungenauigkeiten nicht so sehr ins Gewicht fallen, war viel Genmaterial nötig. Erst in den letzten Jahren wurden die Analyseverfahren soweit verfeinert, dass mittlerweile Auswertungen von einzelnen Zellen möglich sind. Anstatt einen mittleren Expressionswert von mehreren Zellen zu bestimmen, können Unterschiede zwischen einzelnen Zellen festgestellt werden. Zellen können verschiedenen Zelltypen zugeordnet werden, auch wenn sie sich äußerlich oder durch Markergene nicht unterscheiden. Insbesondere können seltene Zelltypen analysiert werden, zumindest wenn es möglich ist sie zu isolieren. Durch weniger Zellen erhält man also mehr Einblick.

Das Fachjournal Nature wählte das Sequenzieren von Einzelzellen zur Methode des Jahres 2013.

Verfahren für Einzelzellen
Genaktivität wird oft anhand der vorhandenen Menge an messenger RNA (mRNA) festgestellt. Ein wichtiges Verfahren ist die qPCR (quantitative polymerase chain reaction). Ähnlich wie bei jeder Zellteilung wird hier die mRNA in mehreren Zyklen vervielfältigt. Dabei werden fluoreszierende Moleküle eingebaut. Die Stärke der Fluoreszenz lässt sich messen und gibt dann Aufschluss über die vorhandene Menge an mRNA.

Um Gene bzw. Genexpression in Zellen sichtbar zu machen (und zu quantifizieren), verwendet man das FISH-Verfahren (fluorescence in situ hybridization). Gene auf den Chromosomen bzw. mRNA werden dabei mit einem fluoreszierenden Farbstoff versehen. Durch Fluoreszenzmikroskopie erhält man ein Bild, das die Gene bzw. ihre Expression anzeigt (Abb. 1).

Ein anderes Verfahren für Einzelzellen verwendet time-of-flight Massenspektrometrie (z. B. CyTOF von DVS Sciences). In einzelnen Zellen können damit über 30 Proteine gleichzeitig quantifiziert werden. Antikörper werden mit Schwermetallionen markiert, die dann an die entsprechenden Proteine binden. Die Zellen werden zerstäubt und die Flugzeiten der einzelnen Bestandteile geben Aufschluss darüber, welche Proteine in den Zellen vorhanden sind.

Erkenntnisse aus Einzelzellanalysen
Zellen teilen sich, sie differenzieren zu unterschiedlichen Zelltypen oder lösen plötzlich den programmierten Zelltod aus. Solche Zellentscheidungen stellen einen wichtigen Anwendungsbereich von Einzelzellanalysen dar. Ziel ist es möglichst früh zu erkennen, welche Veränderungen passieren. Wichtige Indizien sind zum Beispiel Markergene, die durch starke oder niedrige Expression auf eine bestimmte (spätere) Entwicklung der Zelle hinweisen.

In einem Projekt von Dr. Florian Büttner (Helmholtz Zentrum München) [1] geht es darum, die ersten Entwicklungsstufen von Mausembryonen zu verstehen. Nach drei Teilungsschritten besteht der Embryo aus acht Zellen und die Zellen beginnen sich zu unterschiedlichen Zelltypen zu entwickeln (Abb. 2 A). In Experimenten wurden qPCR-Daten von 48 Genen nach jedem Zellteilungsschritt erhoben. Man erhält damit Expressionsmessungen für verschiedene Zelltypen. Um Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden, wird der 48-dimensionale Raum der Gene auf einen z.B. 2-dimensionalen Unterraum projiziert. Jede gemessene Zelle entspricht dann einem Punkt in der Ebene und man kann untersuchen welche Zellen nahe beieinander liegen. Mit Standardprojektionen konnten die Zellen bisher erst nach sechs Teilungsschritten unterschieden werden. Durch eine nicht-lineare Erweiterung, bei der auch die Gruppenzugehörigkeit in die Projektion eingeht, sieht man, dass sich die Zellen bereits nach vier Teilungsschritten in zwei Untergruppen aufteilen (Abb. 2 B, C). Markergene für diese neuen Untergruppen findet man, indem man die Expressionswerte vergleicht.

Mehr Statistik statt weniger Zellen
Obwohl das Sequenzieren von Einzelzellen immer mehr Anwendung findet, bleiben die Verfahren teuer und Messfehler fallen aufgrund der geringen Menge an Genmaterial stärker ins Gewicht. Dr. Christiane Fuchs (Mitautorin) [2] und ihre Kollaborationspartner umgehen dieses Problem mit Hilfe von Statistik.

Ziel des Projektes ist es, verschiedene Zelltypen (Typ I und Typ II) in einer heterogenen Mischung aus Zellen zu bestimmen. Die Zelltypen können zum Beispiel für gesunde Zellen und Krebszellen stehen. Statt Genexpressionen von Einzelzellen zu betrachten ist hier die Lösung „Stochastic Profiling": Aus mehreren Gewebeproben wird zufällig eine kleine Anzahl an Zellen ausgewählt und dann deren gemeinsame Expression bestimmt (Abb. 3). Man erhält dadurch mehr Genmaterial und genauere Messwerte. Für die gemeinsame Genexpression nimmt man ein statistisches Mischmodel an. Ein Parameter gibt dabei die Wahrscheinlichkeit an, mit der eine zufällig ausgewählte Zelle von Typ I bzw. von Typ II ist. Damit wurden drei Gruppen von Genen analysiert. Das Verfahren schätzt, dass in diesen Gruppen 25 %, 10 % bzw. 2,3 % der Zellen ein abweichendes Expressionsmuster aufweisen. Interessant ist vor allem die letzte Gruppe. Da hier die Gene in nur 2,3 % der Zellen auffällig sind, würden sie mit Expressionsanalysen auf Populationen kaum identifiziert werden. Tatsächlich enthält die Gruppe aber Gene, die mit Brustkrebs in Verbindung stehen und das „Stochastic Profiling" liefert bei der begrenzten Anzahl an Proben sogar die besseren Ergebnisse als Einzelzellanalysen.

Referenzen
[1] Büttner F. et al.: Bioinformatics 28, i626-i632 (2012)
[2] Bajikar S.S. und Fuchs C. et al.: PNAS, 201311647 (2014)

Autoren
Katrin Illner, Doktorandin
Dr. Christiane Fuchs, Team-Leiterin Biostatistics
Prof. Fabian J. Theis, Institutsleiter, HMGU & TU München

Mehr Informationen zum Thema: http://bit.ly/GIT-Diagnostik
Institute of Computational Biology: www.helmholtz-muenchen.de/icb

 

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Ingolstädter Landstr. 1
85764 Oberschleißheim
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