Enzyme aus der Natur

Reinstwasser als Grundlage für Metagenomik

  • Biomaten vom Kiritimati Atoll, Zentralpazifik (Foto Dr. Dominik Schneider)Biomaten vom Kiritimati Atoll, Zentralpazifik (Foto Dr. Dominik Schneider)
  • Biomaten vom Kiritimati Atoll, Zentralpazifik (Foto Dr. Dominik Schneider)
  • Abb. 1: Schematische Darstellung zur Konstruktion einer metagenomischen Bibliothek.
  • Abb. 2: Arium pro VF Reinstwasseranlage (Sartorius)
  • Abb. 3: DNA Ausbeute nach Restriktion mit den Endonukleasen BamHI, BclI und BglII. Bei Verwendung von Reinstwasser war die DNA Ausbeute in den präsentierten Experimenten nach jeder Restriktion höher als im Vergleichsexperiment mit unbehandeltem Wasser. Hierbei war der Effekt bei BclI am geringsten und bei BglII am stärksten.
  • Abb. 4: Effizienz der T4-DNA-Ligase mit Reinst- und unbehandeltem Wasser.
  • Abb. 5: Transformationseffizienz mit Reinst- und unbehandeltem Wasser.

Die Metagenomik beschäftigt sich mit der Gesamtheit der genetischen Diversität eines Biotops und seines metabolischen Potentials. Dabei ist es auch möglich die große Fraktion der nicht kultivierbaren Mikroorganismen zu analysieren.Exakte experimentelle Bedingungen sind hierfür ein Schlüsselbestandteil, welcher u. a. auf der Verwendung von Reinstwasser beruht.

Einleitung

Die Biotechnologie bietet eine Vielfalt an Enzymen für die unterschiedlichsten Anwendungen und Einsatzgebiete. Dabei reicht die Palette von molekularbiologischen Werkzeugen über das alltäglich im Haushalt benutzte Waschmittel, bis zu Futterzusätzen in der Viehmast. Die eingesetzten Biokatalysatoren / Enzyme sind nicht nur hocheffizient sondern auch umwelt- und ressourcenschonend. Das liegt am Ursprung der sie umgebenden Umwelt, wo sie als Bestandteile lebender Zellen an Stoffwechselprozessen mitwirken.

Bakterien haben sich als wertvolle Quelle für solche Enzyme für verschiedenste Anwendungen erwiesen. Ihre sequenzierten Genome beherbergen eine Fülle von Genen für verschiedenste Anwendungen.Die einzige Limitierung sind die vorliegenden Genome selbst, denn derzeit können vollständige Genomsequenzen nur von Organismen sequenziert werden, die sich in Reinkultur kultivieren lassen. Dies trifft aber nur auf einen Bruchteil der in der Umwelt existierenden Mikroorganismen zu. Um den hauptsächlichen Anteil der mikrobiellen Welt auf ihr Stoffwechselpotential untersuchen zu können, sind Methoden nötig, die über die klassische Genomik hinausgehen.

Metagenomik

Die Metagenomik setzt sich mit der Gesamtheit der genetischen Diversität eines Biotops auseinander. Dabei kann mittels 16S rRNA-Markergenanalysen die mikrobielle Vielfalt eines Biotops ermittelt werden. Durch direkte Sequenzierung von Umwelt-DNA können neue Genvariationen identifiziert werden, die in kultivierbaren Organismen nicht beobachtet werden. Das Spannendste ist jedoch die Analyse der Umwelt-DNA in Bezug auf bisher nicht beschriebene und völlig unbekannte metabolische Funktionen und den zugrunde liegenden Genen (weiterführende Informationen siehe Coughlan[1]).

In der hier vorliegenden Untersuchung wurde die Bedeutung von Reinstwasser bei der Erzeugung einer metagenomischen Gendatenbank und den zugrundeliegenden Zwischenschritten untersucht.

Der Fokus lag hierbei auf vergleichenden Untersuchungen des Wassers als Lösungsmittel bei der enzymatischen Fragmentierung des genetischen Materials, ihrer Ligation in ein Vektorsystem und der Transformation der erzeugten Konstrukte in ein Escherichia coli-Wirtssystem (Abb. 1). Hierbei wurde unbehandeltes Wasser mit hochreinem Wasser aus der Arium Pro VF Reinstwasseranlage (Sartorius) verglichen (Abb. 2).

Material und Methoden

Alle Versuche wurden parallel mit Reinstwasser und Göttinger Trinkwasser als unbehandeltes Wasser im Triplikat durchgeführt, um Effekte beobachten und quantifizieren zu können. Das Reinstwasser wurde wie bei Nitzki und Herbig [2] beschrieben hergestellt und zeichnet sich durch eine sehr geringe Endotoxinkonzentration von < 0,001 EU/mL, einem TOC Gehalt von bis zu < 2 ppb sowie einer Leitfähigkeit von 0,055 µS/cm (kompensiert auf 25 °C) aus. Das im Vergleich eingesetzte Göttinger Leitungswasser hat dagegen eine typische Leitfähigkeit von 265 – 309 µS/cm und ist daher nicht frei von Ionen etc. [3].

Alle eingesetzten Enzyme wurden von Thermo Fischer Scientific bezogen und nach Herstellerangaben eingesetzt. Genomische DNA wurde aus einer bakteriellen Kultur unter Verwendung des Masterpure Complete DNA and RNA Purification Kit (Epicentre) nach Herstellerangaben gewonnen. Für die Klonierung in ein Vektorsystem wurde die genomische DNA in Einzelreaktionen mit den Endonukleasen BamHI, BclI, BglII verdaut, mittels Nucleospin Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel) gereinigt und äquimolar vereinigt. Die Aufbereitung der genomischen DNA erfolgte parallel mit Reinst- und unbehandeltem Wasser.

Das pUC19 Vektorsystem wurde für die Aufnahme der genomischen DNA verwendet. Hierfür wurde der Vektor mit der Endonuklease BamHI verdaut und damit für die Aufnahme von mit BamHI, BclI und BglII erzeugten Fragmenten kompatible Überhänge erzeugt. Abschließend wurde der geschnittene Vektor mit FastAP nach Herstellerangaben dephosphoryliert um Religation auszuschließen und analog der genomischen DNA gereinigt. Die Aufbereitung des Vektors erfolgte parallel mit Reinst- und unbehandeltem Wasser.

Ligation erfolgte unter Verwendung der T4 DNA-Ligase nach Herstellerangaben, wobei parallel mit Reinst- und unbehandeltem Wasser gearbeitet wurde.

Kompetente E. coli Zellen wurden ausschließlich mit Reinstwasser als Lösungsmittel hergestellt und für alle Experimente eingesetzt. Hierbei wurde nach dem Inoue-Protokoll verfahren [4]. Die fertigen Zellen wurden bis zur Verwendung bei -80°C kryokonserviert.

Für die Transformation wurden die chemisch kompetenten Zellen (200 µl) auf Eis aufgetaut und auf den vorgekühlten Ligationsansatz gegeben. Die so durchmischte Suspension wurde für 10 min auf Eis inkubiert, auf einem 42 °C Metallblock für 60 sec Hitzeschock-behandelt und erneut für 10 min auf Eis inkubiert. Die transformierten Zellen wurden mit SOC-Medium versetzt, für 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend auf selektive LB-Platten ausgebracht. Die Inkubation der Platten erfolgte für 16 Stunden bei 37 °C.

Ergebnisse und Diskussion

Für die Fragmentierung des genetischen Ausgangsmaterials wurden die Endonukleasen BamHI, BclI und BglII eingesetzt. Jedes für sich hat eine spezifische Erkennungssequenz und schneidet an unabhängiger Stelle. Das garantiert eine umfangreiche Abdeckung der zu untersuchenden Probe. Alle erzeugten DNA-Überhänge sind hierbei kompatibel zu dem mit BamHI vorbereiteten Vektorsystem. Beim vergleichenden Einsatz von Reinst- und unbehandeltem Wasser ist deutlich geworden, dass die Verwendung von Reinstwasser die finale DNA Ausbeute positiv beeinflusst (siehe Abb. 3). Die eingesetzten Typ II Endonukleasen benötigen für ihre Aktivität divalente Kationen. Oft handelt es sich hierbei um Mg2+, wobei sich auch Zn2+, Ni2+ und andere, abhängig vom Enzym eignen. Calciumionen hingegen wirken oft inhibitorisch und blockieren das Enzym in seiner Funktion (zusammengefasst in Pingoud et al. [5]). Somit liegt es nahe, dass die Abwesenheit von Calciumionen im eingesetzten Reinstwasser optimale Bedingungen für die Aktivität der eingesetzten Endonuklease schaffen.

Die T4-DNA-Ligase ist ein häufig verwendetes Enzym für die Integration der vorbereiteten DNA-Fragmente in ein geeignetes Vektorsystem. Hierbei werden die vorbereiteten DNA-Fragmente kovalent mit dem Vektorsystem verbunden und anschließend in das E. coli Wirtssystem übertragen. Der Einsatz von Reinstwasser im Vergleich zum unbehandelten Wasser, hat sich im Ligase-Kontrollexperiment als vorteilhaft erwiesen, was sich deutlich in fünfmal höherer Kolonienzahl der angeschlossenen Transformation zeigte (Abb. 4). Da Ligasen empfindlich gegen manche Anthracycline [6] und reaktive Stickstoffoxidspezies [7] sind, beruht der Vorteil des verwendeten Reinstwassers möglicherweise auf seinem hohen Reinheitsgrad.

Der letzte kritische Schritt für die Erzeugung einer metagenomischen Bank ist die Übertragung der DNA-Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem. Die Transformation chemisch-kompetenter E. coli Zellen [4] war hier die Methode der Wahl. Die kompetenten Zellen werden hierbei gekühlt in einer Hochsalzlösung vorgehalten und durch die Zugabe von DNA für die Transformation vorbereitet. Die Transformation erfolgt anschließend mittels eines Hitzeschocks. Um beurteilen zu können, ob Wasser einen Effekt auf den Transformationsprozess hat, wurden 40 ng frisch präparierter Vektor in Reinst- und unbehandeltem Wasser aufgenommen und in das Wirtssystem transformiert. Da dieser Prozess in einer Hochsalzlösung abläuft und keine Enzyme beteiligt sind, wurden bei den beiden Wässern keine großen Unterschiede erwartet. Die experimentellen Daten wiesen jedoch einen eindeutigen Effekt auf (siehe Abb. 5).

Schlussfolgerung und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in allen hier vorgestellten kritischen Schritten der metagenomischen Vorgehensweise, die Verwendung von Reinstwasser klare Vorteile aufwies. Es konnte gezeigt werden, dass Endonukleasen im Puffersystem, das mit Reinstwasser hergestellt wurde, zuverlässiger DNA fragmentieren und eine effizientere Aufbereitung des wertvollen Materials gestatten. Der Ligationsprozess war mindestens doppelt so effizient wie im unbehandelten Wasser. Das ist von essentieller Bedeutung bei der Aufbereitung einzigartiger Proben aus unangetasteten Biotopen, wie beispielsweise von mikrobiellen Matten des Kiritimati Atolls (Zentralpazifik) [8]. Eine möglichst vollständige und umfangreiche Aufarbeitung solch wertvoller genetischer Materialien ist erstrebenswert. Dabei ist es empfehlenswert, sich nicht nur auf die kritisch enzymatischen Schritte zu beschränken, sondern Reinstwassers auch in den als robust geltenden Abschnitten zu nutzen. In unseren Versuchen ist das am besten an der erhöhten Transformationsrate der chemisch kompetenten Zellen deutlich geworden.

In Zukunft wäre es interessant, experimentell zu überprüfen, wie sich die Reinheit des verwendeten Wassers als Lösungsmittel auf weiterführende Schritte der Metagenomik, wie Sequenzierung oder funktionale Durchmusterung, auswirkt. Erkenntnisse dieser Art steigern die Sensitivität der Metagenomik und ermöglichen somit die Untersuchung von in geringsten Mengen vorkommender Organismen und ihrer Fähigkeiten, die ansonsten in einer Untersuchung nicht auffallen würden. Hierzu müssten letztendlich weiterführende Versuche durchgeführt werden.

Danksagung

Ein besonderer Dank der Autoren gilt Herrn Prof. Dr. Rolf Daniel für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie der gesamten Abteilung für Genomische und Angewandte Mikrobiologie der Georg-August-Universität Göttingen für die konstruktive Diskussion zum Thema.

Autoren
Neil Singh1, Elmar Herbig2, Robert Hertel1

Zugehörigkeiten
1Georg-August-Universität Göttingen, Institut für Mikrobiologie und Genetik, Abteilung für Genomische und Angewandte
Mikrobiologie, Göttingen, Deutschland
2Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG, Göttingen, Deutschland

Kontakt  
Elmar Herbig
Sartorius Lab Instruments GmbH & Co. KG
Göttingen, Deutschland

Referenzen:

1. Coughlan LM, Cotter PD, Hill C, Alvarez-Ordóñez A. 2015. Biotechnological applications of functional metagenomics in the food and pharmaceutical industries. Frontiers in Microbiology 6:672.

2. Nitzki F, Herbig E. 2013. In-situ Hybridisierung. Die Bedeutung von Reinstwasser für RNA Technologien. GIT Labor-Fachzeitschrift 3:157-159.

3. Trinkwasser Analyse 2017 der Stadtwerke Göttingen AG.

4. Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

5. Pingoud A, Wilson GG, Wende W. 2014. Type II restriction endonucleases - a historical perspective and more. Nucleic Acids Research 42:7489–7527.

6. Montecucco A, Pedrali-Noy G, Spadari S, Zanolin E, Ciarrocchi G. 1988. DNA unwinding and inhibition of T4 DNA ligase by anthracyclines. Nucleic Acids Research 16:3907–3918.

7. Graziewicz M, Wink DA, Laval F. 1996. Nitric oxide inhibits DNA ligase activity: potential mechanisms for NO-mediated DNA damage. Carcinogenesis 17:2501–2505.

8. Schneider D, Arp G, Reimer A, Reitner J, Daniel R. 2013. Phylogenetic Analysis of a Microbialite-Forming Microbial Mat from a Hypersaline Lake of the Kiritimati Atoll, Central Pacific. PLOS ONE 8:e66662.

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