Epigenetische Modifikationen und Regulation der Genexpression

Die vier kanonischen Nukleobasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin sind der Grundbestandteil des genetischen Codes jedes Lebewesens. Obwohl jede Zelle im menschlichen Körper die gleiche Abfolge an DNA Bausteinen enthält, sind mehr als 200 verschiedene Zelltypen bekannt, welche sich teils stark in ihrer Morphologie und Funktion unterscheiden. Neben der Sequenz der Nukleobasen muss es also eine zweite Informationsebene geben, die die Genexpression orchestriert.

Jede einzelne Zelle eines Säugetiers entstammt einer Vorläuferzelle, der Stammzelle. Während der Differenzierung dieser Zellen zu Geweben oder Organen wird die chemische Struktur des 2‘-Desoxycytidins (dC) verändert. Bei der Stilllegung von Genen wird dC an Position 5 durch die DNA Methyltransferasen (DNMT) zu Methyl-dC (mdC) methyliert [1]. Eine Demethylierung von mdC zu dC erzeugt hingegen ein aktiviertes Gen, welches dann wieder exprimiert werden kann (Abb. 1). Obwohl die Stilllegung und Aktivierung eines Gens durch Methylierung und Demethylierung schon lange bekannt ist, ist die chemisch anspruchsvolle Entfernung der Methylgruppe an Position 5 noch nicht vollständig verstanden. 2009 konnte Hydroxymethyl-dC (hmdC) in genomischer DNA gefunden werden, kurz darauf wurden 2011 auch die oxidierten Derivate Formyl-dC (fdC) und Carboxy-dC (cadC) in Stammzellen identifiziert [2]. Diese nicht-kanonischen Basen werden durch die schrittweise Oxidation von mdC zu hmdC, fdC und cadC durch die Ten eleven translocation (Tet) Enzyme erzeugt (Abb. 1) und haben vermutlich eine wichtige Funktion in der aktiven Demethylierung. Obwohl sich ein Großteil der Forschung auf die direkten biologischen Konsequenzen dieser Modifikationen konzentriert, ist meist ein signifikanter Anteil an chemischer Synthese nötig, welche in der Folge biologische Experimente erst ermöglicht. In diesem Artikel wollen wir auf Methodiken eingehen, um diese fundamentalen Fragen beantworten zu können.

Quantifizierung von epigenetischen Modifikationen
Zu Beginn ist es wichtig, dass man das Vorkommen und die Häufigkeit der Modifikationen in verschiedenen Geweben und Zelltypen und auch deren Dynamik in verschiedenen Entwicklungsstadien kennt.

Mit Hilfe chromatographischer Auftrennung von DNA Nukleosiden und massenspektrometrischer Analyse (HPLC-MS) ist es möglich, eine genaue und sensitive Quantifizierung dieser Basen zu realisieren [3]. Nach Isolation der DNA aus einem bestimmten Gewebe wird diese enzymatisch auf Nukleosidebene verdaut (Abb. 2). Daraufhin wird dem DNA Hydrolysat eine definierte Menge eines synthetischen Isotopologs zugegeben, welcher eine spezifische Markierung mit schweren Isotopen aufweist. Dieses synthetische Nukleosid dient als interner Standard, da es die gleichen Eigenschaften in Bezug auf Chromatographie und Ionisierung wie die jeweiligen natürlichen Verbindungen hat. Aufgrund des Masseunterschieds werden zwei spezifische Signale bei der nachfolgenden MS-Analyse erhalten. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Modifikation durch Integration des erhaltenen Signals und direkten Vergleich mit dem des Isotopologs. So wurde festgestellt, dass hmdC sehr weit verbreitet ist. Besonders interessant ist, dass im menschlichen Gehirn bis zu 1.2 % hmdC (in Bezug  auf dC) gefunden werden kann [4].

Synthese modifizierter DNA für die Untersuchung von biologischen Systemen
Synthese von Bausteinen für die Festphasensynthese
Die komplexen Funktionen und Eigenschaften dieser Modifikationen innerhalb eines biologischen Systems können nur durch Erweiterung der Forschung weg von den monomeren Nukleosiden hin zu polymeren DNA-Strukturen bestimmt werden. Sequenzierungsmethoden für die genomweite Lokalisierung von hmdC und fdC in DNA ermöglichen es, diese Basen im Sequenzkontext zu identifizieren. Dieses Wissen befähigt zur Synthese spezifischer Oligodesoxyribonukleotide (ODN), die an bestimmten Stellen die Modifikationen tragen und damit die natürlichen Strukturen nachahmen. Dafür müssen zunächst Phosphoramidite entwickelt werden, welche für die DNA-Festphasensynthese geeignet sind (Abb. 3). Dazu ist ein tiefes Wissen über die Reaktivität der neuen Bausteine nötig, damit ihrer höheren Empfindlichkeit während der automatisierten Synthese Rechnung getragen wird (z. B. bei fdC elektrophiler Michael-Akzeptor, erhöhte Oxidationsempfindlichkeit). Diese müssen stabil genug sein, um der Synthese standzuhalten, aber auch labil genug sein, um bei der Entschützung der synthetischen ODN wieder abgespalten zu werden. Die von unserer Gruppe entwickelten Bausteine der epigenetisch relevanten Basen sind mittlerweile kommerziell erhältlich (Abb. 3) [5].

Nun können diese ODN für physikalisch organische Studien verwendet werden. Dabei kann man herausfinden, wie diese Modifikationen die Struktur und Stabilität der DNA verändern. Außerdem können die ODN in modernen Verfahren wie z. B. der Proteomics, verwendet werden, wo in biochemischen Experimenten das Zusammenspiel der Modifikation mit den Schlüsselenzymen näher untersucht werden kann.

Mechanistische Studien
2012 wurde in unserer Gruppe die Synthese eines 15N2-markierten cadC-Phosphoramidits entwickelt, welcher für ein Isotopenverfolgungsexperiment verwendet wurde (Abb. 3). Dabei sollte untersucht werden, ob mdC über Oxidation zu cadC und anschließender Decarboxylierung aktiv zu dC demethyliert werden kann [6]. In dieser Studie wurde der Baustein (Abb. 3) in ein 30mer mit der Sequenz eines Promotorelements eingebaut, von dem man weiß, dass es bei der aktiven Demethylierung eine Rolle spielt. Außerdem wurde das ODN mit einem Biotin-Tag versehen, welcher später zur Affinitätsaufreinigung genutzt wurde. Nach erfolgter Inkubation des DNA-Strangs mit Zellkernextrakt aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESC) wurde das ODN mit Hilfe von magnetischen Streptavidin Partikeln reisoliert (Abb. 3). Der Strang wurde daraufhin enzymatisch verdaut und mit Hilfe von HPLC-MS analysiert. Tatsächlich konnte das Decarboxylierungsprodukt 15N2-dC im Gemisch gefunden werden und somit wurde gezeigt, dass im nuklearen Extrakt von mESC cadC direkt zu dC decarboxyliert wird. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass es einen oxidations-abhängigen aktiven Demethylierungsweg von mdC gibt und die Suche nach den verantwortlichen Proteinen ist immer noch ein großer Bestandteil unserer Forschung.

Identifizierung spezifischer Interaktoren
Eine Möglichkeit zur Ermittlung der für diesen Reaktionsweg verantwortlichen Enzyme bietet die Verwendung von biotinylierten ODNs, welche sich in ihrem dC Kontext unterscheiden. Diese werden dann als „Köder“ für Proteininteraktoren in Zelllysaten verwendet. Da wir ein besseres Verständnis über die Regulation von spezifischen Genen während der Zellreprogrammierung haben wollen, sind mESC besonders interessant. Analog zu unseren mechanistischen Studien werden über die Streptavidin Partikel die „Köder“-ODNs aus dem Lysat angereichert und zugleich an die jeweilige DNA-Sequenz bindende Proteine herausgefischt. Die Verwendung von verschiedenen an MS gekoppelten Proteomic-Techniken (z. B. SILAC [7]) erlauben die Bestimmung der spezifischen Interaktoren (Abb. 3).  Dadurch können Rückschlüsse auf Proteine gezogen werden, welche von den jeweiligen Modifikationen angezogen bzw. abgestoßen werden. In Kollaboration mit Prof. Vermeulen (Universität Nijmegen) konnten dadurch mit Hilfe von SILAC/MS die Proteininteraktoren von hmdC, fdC und cadC identifiziert werden, welche vermutlich an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind [7]. Studien solcher Art helfen uns, Interaktoren zu identifizieren und somit deren Funktion bei der aktiven Demethylierung zu entziffern.

Unsere Gruppe besteht aus synthetischen Chemikern, Biologen sowie Biochemikern, mit denen wir fundamentalen Fragen der Epigenetik nachgehen. Diese Zusammensetzung erlaubt es uns, neuartige Experimente durchzuführen, die sich an der Schnittstelle zwischen Chemie und Biologie befinden. Da es unser Ziel ist, die Hauptakteure der Genregulation zu identifizieren, sind wir an der Entwicklung neuer Methoden, welche sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Industrie nützlich sind, interessiert.
 

Literatur
[1] J. A. Law, S. E. Jacobsen: Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals, Nature Reviews Genetics 11, 204-220 (2010) – DOI: 10.1038/nrg2719
[
2] T. Pfaffeneder et al.: The Discovery of 5-Formylcytosine in Embryonic Stem Cell DNA, Angewandte Chemie International Edition 50, 7008-7012 (2011) – DOI: 10.1002/anie.201103899
[
3] D. Globisch et al.: Tissue Distribution of 5-Hydroxymethylcytosine and Search for Active Demethylation Intermediates, PLoS One 5, e15367 (2010) - DOI: 10.1371/journal.pone.0015367
[
4] M. Wagner et al.: Age-Dependent Levels of 5-Methyl-, 5-Hydroxymethyl-, and 5 Formylcytosine in Human and Mouse Brain Tissues, Angewandte Chemie International Edition – DOI: 10.1002/anie.201502722
[
5] A.S. Schroder et al.: Synthesis of a DNA Promoter Segment Containing All Four Epigenetic Nucleosides: 5-Methyl-, 5-Hydroxymethyl-, 5-Formyl-, and 5-Carboxy-2′-Deoxycytidine, Angewandte Chemie International Edition 53, 315-318 (2014) – DOI: 10.1002/anie.201308469
[
6] S. Schiesser et al.: Mechanism and Stem-Cell Activity of 5-Carboxycytosine Decarboxylation Determined by Isotope Tracing, Angewandte Chemie International Edition 51, 6516–6520 (2012) – DOI: 10.1002/anie.201202583
[
7] C.G. Spruijt et al.: Dynamic Readers for 5-(Hydroxy)Methylcytosine and Its Oxidized Derivatives, Cell 152, 1146 (2013) – DOI: 10.1016/j.cell.2013.02.004          

Autoren
Prof. Thomas Carell
Dr. Iacovos Michaelides
Rene Rahimoff

Ludwig-Maximilians-Universität München
Fakultät für Chemie und Pharmazie
München

Thomas.carell@cup.lmu.de
iamich@cup.uni-muenchen.de
rene.rahimoff@cup.uni-muenchen.de

Mehr zum Thema Epigenetik: http://www.git-labor.de/category/tags/epigenetik
Epigenetik - kurz erklärt: http://www.spektrum.de/thema/epigenetik/1191602

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