Erweiterung des Genetischen Codes: Eine Methode mit Potenzial

  • Abb. 1: Erweiterung des genetischen Codes durch Expression eines evolvierten orthogonalen Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Paares in der Zelle. Die nnAS wird durch das endogene Transportsystem aus dem Nährmedium aufgenommen und von der Synthetase auf die tRNA geladen. Die tRNA supprimiert das Stopp-Codon auf der mRNA, wodurch die nnAS an der codierten Position im Protein eingebaut wird.Abb. 1: Erweiterung des genetischen Codes durch Expression eines evolvierten orthogonalen Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Paares in der Zelle. Die nnAS wird durch das endogene Transportsystem aus dem Nährmedium aufgenommen und von der Synthetase auf die tRNA geladen. Die tRNA supprimiert das Stopp-Codon auf der mRNA, wodurch die nnAS an der codierten Position im Protein eingebaut wird.
  • Abb. 1: Erweiterung des genetischen Codes durch Expression eines evolvierten orthogonalen Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Paares in der Zelle. Die nnAS wird durch das endogene Transportsystem aus dem Nährmedium aufgenommen und von der Synthetase auf die tRNA geladen. Die tRNA supprimiert das Stopp-Codon auf der mRNA, wodurch die nnAS an der codierten Position im Protein eingebaut wird.
  • Abb. 2: Oben: Modifikationsschema. Die nnAS mit bioorthogonaler Funktion wird über die Erweiterung des genetischen Codes in ein Protein eingebaut und anschließend z. B. mit einem Fluorophor markiert. Diese Reaktionen können unter physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und ermöglichen auch Anwendungen in vivo. Unten: Beispiele für nnAS.
  • Abb. 3: Zelluläres und orthogonales Ribosom arbeiten parallel, aber unabhängig, in einer Zelle. Schwarze Pfeile zeigen starke und gestrichelte, graue Pfeile keine Interaktionen an. Wt-mRNA: Wildtyp messenger RNA, O-mRNA: orthogonale messenger RNA, Wt-rRNA: Wildtyp ribosomale RNA, O-rRNA: orthogonale ribosomale RNA.

Der genetische Code ist bis auf wenige Ausnahmen universell konserviert und besteht aus 64 verschiedenen Triplet-Codons, die allesamt genutzt werden, um die zwanzig natürlichen Aminosäuren und den Abbruch der Peptidsynthese zu codieren. Einige Organismen haben ihren Translationsapparat bereits ergänzt, z. B. um Selenocystein oder Pyrrolysin. Dasselbe Prinzip kann genutzt werden, um die Einschränkungen der kanonischen Aminosäuren in anderen Organismen künstlich zu überwinden und die Nutzung weiterer Funktionalitäten zu ermöglichen. So wurden u. A. UV induzierbare Quervernetzer, spektroskopierbare Proben,funktionelle Gruppen mit bioorthogonaler Reaktivität, und posttranslationale Modifikationen selektiv in Proteine eingebaut, und ermöglichen einen breiten Anwendungsbereich.

Methodik
Entscheidend für die Strategie zur Erweiterung des genetischen Codes ist die Modifikation und Weiterentwicklung (Evolvierung) von Aminoacyl-tRNA Synthetasen (kurz Synthetasen), die spezifisch für nicht natürliche Aminosäuren (nnAS) und die dazugehörigen tRNAs sind. Da dieser Einbau zusammen mit der restlichen Translation abläuft, muss das System orthogonal zur konventionellen Proteinsynthese sein. Das bedeutet, dass die orthogonale tRNA nicht von den endogenen Synthetasen erkannt wird und die orthogonale Synthetase keine endogenen tRNAs beladen darf. Das Anticodon der tRNA ist in der Regel gegen ein Stopp-Codon gerichtet, dessen eigentliche Funktion dadurch supprimiert wird (Abb. 1).

Für die Entwicklung einer neuen Synthetase wird zunächst durch Austausch von Aminosäureresten im aktiven Zentrum eine Bibliothek von Mutanten erzeugt. Durch mehrere Runden positiver und negativer Selektion werden spezifische Synthetasen aus der Bibliothek isoliert. Dazu werden E. coli Zellen mit der Plasmidbibliothek und einem Reporterplasmid transformiert, welches ein Antibiotikaresistenzgen trägt, das durch ein Stopp-Codon unterbrochen ist. Erkennt eine Synthetase in Anwesenheit der nnAS entweder diese oder eine natürliche Aminosäure und belädt die entsprechende tRNA, wird das Stopp-Codon unterdrückt und die Zellen resistent gegenüber dem Antibiotikum.

Synthetasen, die natürliche Aminosäuren erkennen, werden in der anschließenden Negativselektion eliminiert. Hierfür wird das Stopp-Codon in ein toxisches Gen eingebaut. Wenn nun in Abwesenheit der nnAS eine Synthetase aktiv und das toxische Gen translatiert wird, stirbt die Zelle. So können orthogonale Synthetasen, die bestimmte nnAS erkennen, aus der Bibliothek isoliert werden. Mit diesem Ansatz wurden mittlerweile schon fast hundert nnAS zum genetischen Code verschiedenster Organismen hinzugefügt [1].

Anwendungen
Proteine mit posttranslationalen Modifikationenkönnen mit dieser Methode ohne die Kenntnis der beteiligten Enzyme direkt und homogen hergestellt werden. Dies nutzte die Gruppe um Chin, um N(ε)-Acetyllysin (Abb.2) direkt in das Histon H3 an Position 56 einzubauen. Damit konnten sie nachweisen, dass die Acetylierung dieses Restes die DNA-Atmung beeinflusst und auch Effekte auf die Reorganisation der Mononukleosomen hat.

Quervernetzung
Photocrosslinker, wie z. B. p-Benzoylphenylalanin (BPA), ermöglichen die Aufklärung von Protein-Protein und Protein-DNA Interaktionen in vivo. Bei Bestrahlung mit UV-Licht bildet es Diradikale, welche mit einem sich in der Nähe befindlichen Interaktionspartner eine kovalente Bindung eingehen. Die Interaktionspartner können dann mittels Western blot oder Massenspektrometrie detektiert werden. Kahne und Mitarbeiter benutzten den Einbau von BPA an unterschiedlichen Positionen von Lipopolysaccharid-Transportern, um die Bewegung des Lipopolysaccharides von der inneren Membran bis zur Zelloberfläche zu verfolgen. Durch die Quervernetzung konnten erstmals Zwischenschritte fixiert und somit die Aufgabe der einzelnen Interaktionspartner ermittelt werden [2].

Isotopenmarkierung für die NMR-Spektroskopie
Für die Untersuchung von Proteinen mittels NMR Spektroskopie müssen diese Spin-markiert werden. Dazu werden Zellen normalerweis ein 13C-Glucose und 15N-Ammoniumhaltigem Medium kultiviert, wodurch das Protein gleichmäßig markiert wird. Die Markierung einer einzelnen Aminosäure z. B. im aktiven Zentrum eines Enzyms, erlaubt die Untersuchung der chemischen Umgebung während der Katalyse. Dies kann man erreichen, indem man eine isotopenmarkierte natürliche Aminosäure mit einer Schutzgruppe einbringt und diese anschließend entfernt oder direkt eine modifizierte isotopenmarkierte nnAS einbaut. Auch das NMR aktive 19F konnte schon erfolgreich in Form von fluorierten Derivaten der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Lysin mit dem Stopp-Codon-Suppressionssystem eingebaut werden.

Weitere Spektroskopiemethoden
Unter den nnAS befinden sich auch einige mit guten Infrarotabsorptionseigenschaften, wie das p-Azidophenylalanin (AzF). Die Azidogruppe mit seiner asymmetrischen Streckschwingung konnte bereits benutzt werden, um schnelle Konformationswechsel in Rhodopsin zu verfolgen.

Die Fluoreszenzspektroskopie erlaubt die Untersuchung der Dynamik von Proteinen mit sehr hoher Auflösung und Sensitivität bis hin zur Einzelmolekülspektroskopie. Dazu müssen diese mit einem Farbstoff modifiziert werden. Hier eignen sich nnAS mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen, die sich z. B.in einer 3+2 Zykloaddition („Klickreaktion") modifizieren lassen. Diese verbindet klassischerweise ein Alkin mit einem Azid, wobei ein zelltoxischer Cu(I) Katalysator benötigt wird, der die Reaktion auf in vitro Anwendungen beschränkt. Weiterentwicklungen, die sich stark gespannter Ringsysteme bedienen, können auf den Katalysator vollständig verzichten und ermöglichen so auch den Einsatz in vivo. Der Energietransfer zwischen zwei Farbstoffen (FRET) mit geeigneten spektralen Eigenschaften wird eingesetzt, um Faltung oder Konformationsänderungen von Proteinen zu beobachten. Hierbei nutzt man die Änderung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der Distanz zwischen einem Donor und einem Akzeptor-Fluorophor. Um ein Protein mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren zuversehen, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Ein Farbstoff kann über eine fluoreszierende nnAS oder eine andere nichtnatürliche Funktion, die dann mit einem Fluoreszenzfarbstoff verknüpft wird, eingebracht werden. Der Andere kann über natürliche Cysteine, die gut und effektiv mit Maleimiden reagieren, konjugiert werden, wobei diese Methode auf cysteinfreie Proteine beschränkt ist. Alternativ kann der zweite Farbstoff über die Affinität zu einer definierten Peptidsequenz, z. B.Flash-Tag, oder in Form eines fluoreszenten Proteins angebracht werden.

Chakraborty et al. benutzten den separaten Einbau von AzF in zwei Untereinheitender RNA-Polymerase-Klammer und konnten so die beiden Untereinheiten mit Hilfe der Staudinger-Ligation mit unterschiedlichen Fluorophoren markieren. Nach der Rückfaltung der Einheiten konnte dann das Öffnen und Schließen der Klammer über Einzelmolekül-FRET verfolgt werden [3].

Orthogonale Ribosomen
Für den Einbau von zwei oder mehr unterschiedlichen nnAS in ein Protein bedarf es weiterer Modifizierungen des vorhandenen Systems. Um der Limitierung durch Stopp-Codons zu entgehen, werden nicht codierende, so genannte blank codons benötigt. Die Erweiterung des genetischen Codes von Triplet- auf Quadruplet-Codons würde theoretisch 256 blank codons bieten, die für den Einbau ebenso vieler neuer Verbindungen genutzt werden könnten. Allerdings werden pro weiterem Codon auch neue Synthetase/tRNA Paare benötigt, die orthogonal zu den bereits in der Wirtszelle vorhanden Paaren sein müssen und den Einbau der jeweiligen nnAS bewirken. Nicht zuletzt muss das Ribosom so modifiziert werden, dass es mit den Komponenten eine effiziente Synthese durchführen kann. Außerdem dürfen all diese Veränderungen nicht mit der Synthese der zelleigenen Proteine interferieren, was andernfalls zum Tod der Zelle führen würde.

Durch die Entwicklung eines parallelen Translationsapparates schufen Chin und seine Mitarbeiter eine Art Arbeitskopie des Ribosoms, das dadurch von den Zwängen der Proteinsynthese befreit, hin zu neuen Eigenschaften evolviert werden konnte. Sie erreichten dies durch Mutation der Shine-Dalgarno-Sequenzauf der mRNA und der entsprechenden komplementären Sequenz in der 16S rRNA der kleinenUntereinheit des Ribosoms. Dadurch entstanden mehrere orthogonale Ribosom/mRNA Paare, die parallel, aber unabhängig zu ihren unveränderten Vorgängern in der Zelle arbeiten können. Das heißt, die orthogonalen Ribosomen translatieren ausschließlich die orthogonalem RNA, die wiederrum kein Substrat für die zellulären Ribosomen ist.

Die Änderung von zwei Basen in der 16S rRNA der orthogonalen Ribosomen erhöhte die Effizienz des Einbaus von nnAS gegenübereinem Stopp-Codon deutlich, was vermutlich auf eine verringerte Interaktion des mutierten Ribosoms mit dem release factor-1, einem Protein, das für die Beendigung der Translation verantwortlich ist, zurückzuführen ist. Die Mutation zweier weiterer Basen der 16S rRNA, nahe der Bindungsstelle des Anticodons der tRNAs, verbesserte die Einbaueffizienz von nnAS gegenüber Quadruplet-Codons um ein Vielfaches. Mit Hilfe dieser evolvierten Ribosomen ist es nun möglich, verschiedene Kombinationen von nnAS im selben Protein zu codieren [4].

Chin und Mitarbeiter nutzten diese Komponenten, um eine Azid- und eine Alkin-Funktion im selben Protein einzubauen, die anschließend durch eine Klickreaktion eine artifizielle redoxstabile Quervernetzung bildeten. Solche Quervernetzungen könnten z. B. dazu benutzt werden, therapeutisch relevante Proteine zu stabilisieren.

Ausblick
Bisher konnten mit der Erweiterung des genetischen Codes schon viele neue Funktionalitäten in Proteine eingebaut und für verschiedenste Anwendungsbereiche genutzt werden. Trotzdem sind noch längst nicht alle Anwendungsmöglichkeiten erschlossen und für eine bessere Nutzbarkeit wäre eine größere Vielfalt an Funktionalitäten wünschenswert.

Zukünftige Arbeiten in diesem Bereich können auch darauf abzielen, die vorgestellten Techniken zu nutzen, um neue Codons mit ihren dazugehörigen Synthetase/tRNA Paaren zu entwickeln und so mit Hilfe der orthogonalen Ribosomen mehrere nnASoder andere Monomere, die nicht mit den α-L-Aminosäuren verwandt sind, in Proteine einzubauen. Die Rolle der tRNA als Adapter zwischen der Codierung des Protein durch die mRNA und der eigentlichen Proteinbiosynthese durch das Ribosom sorgt für die chemische Unabhängigkeit von Produkt und Vorlage. Diese Unabhängigkeit sollte es möglich machen auch beliebige Kombinationen von Monomeren, bis hin zu völlig nichtnatürlichen Polymeren herzustellen, ohne dabei die klassische Art der Speicherung der Bauanleitung über DNA / RNA zuverändern (Abb. 3). Die kombinierte Biosynthese könnte in der Zukunft zur Herstellungvon neuen Materialien und Therapeutika Verwendung finden.

Literatur
[1] Neumann H.: FEBS Lett. 586, 2057-2064(2012)
[2] Okuda S. et al.: Science 338F 1214-1217(2012)
[3] Chakraborty A. et al.: Science 337, 591-595(2012)
[4] Wang K. et al.: Angew. Chem. Int. Ed. 51,2288-2297 (2012)

 

Mehr Informationenzum Thema: http://bit.ly/RNA-Technologie

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Justus-von-Liebig-Weg 11
37077 Göttingen

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