Fluoreszenzmarkierung isomerer Zucker

Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie zur Analyse von Glykanen

  • Abb. 1: Schematische Darstellung einer Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe und Form mittels Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS).
  • Abb. 2: Übersicht über die verwendeten Modellglykane und Derivatisierungsarten. A) Vereinfachte Darstellung der sechs fucosylierten Tri- und Tetrasaccharide anhand von Symbolen (symbol nomenclature for glycans, SNFG). B) Vergleich der Modifizierungen am reduzierenden Ende der eingesetzten Tri- und Tetrasaccharide. ProA, 2-AA und 2-Ab sind typische Fluoreszenzlabel, während das Alditol einen Vergleich zwischen der offenkettigen (Red) und der zyklischen Pyranose-Struktur (nativ) ermöglicht.
  • Abb. 3: Darstellung der CCS Unterschiede (in Prozent) zwischen den jeweiligen Isomerenpaaren als Heatmap.
Unter den Biomolekülen nehmen komplexe Oligosaccharide – auch Glykane genannt – eine Sonderrolle ein. Im Gegensatz zu DNA und Proteinen weisen sie oft verzweigte, nicht-lineare Strukturen auf, die in diversen biologischen Prozessen, beispielsweise in der Zellerkennung und im Informationstransfer von lebenden Organismen eine Rolle spielen. Für die schnelle Charakterisierung dieser komplexen Moleküle kann die Ionenmobilitäts–Massenspektrometrie in Kombination mit Flüssigchromatographie eine zentrale Rolle einnehmen.
 
Kohlenhydrate umgeben uns im Alltag, ihre biologische Rolle in lebenden Organismen wird jedoch häufig unterschätzt. Die biologische Funktion ist ähnlich wie bei Proteinen von der zugrundeliegenden Struktur abhängig. Polysaccharide sind strukturell eher einfach und finden sich häufig in freier Form, zum Beispiel als Gerüststoffe in Zellulose oder als Energiequelle in Form von Stärke. Darüber hinaus kommen kleinere, strukturell komplexere Zucker aber auch als kovalent gebundene Spezies an Proteinen und Lipiden vor, wo sie zum Beispiel eine wichtige Rolle als Sensoren für die Kommunikation zwischen Zellen spielen [1]. Die Grundbausteine komplexer Zucker sind Monosaccharide, Polyhydroxyaldehyde und Polyhydroxyketone, die sich oft lediglich in der stereochemischen Orientierung einzelner Hydroxylgruppen unterscheiden (z. B. Glucose vs. Galactose). Zwei solcher Monosaccharide können potenziell an jeder Hydroxylgruppe miteinander verknüpft sein, wodurch eine Vielzahl von Konnektivitätsisomeren möglich ist. Zusätzlich entsteht bei jeder Verknüpfung ein neues Stereozentrum, sodass zwei unterschiedliche Konfigurationsisomere gebildet werden können. Die Kombination dieser drei Strukturmerkmale (Komposition, Konnektivität und Konfiguration) führt zu einer immensen strukturellen Vielfalt mit einer Vielzahl unterschiedlicher biologischer Funktionen. Aufgrund des isomeren Charakters lassen sich komplexe Glykane nur schwer mittels Massenspektrometrie (MS) anhand ihrer Molekülmasse unterscheiden [2].
 
Strukturaufklärung mittels Flüssigchromatographie
Typischerweise wird deshalb eine Kombination aus Flüssigchromatographie (LC) und MS verwendet.

Für die Trennung von isomeren Zuckern existieren viele chromatographische Methoden, unter denen sich die hydrophile Interaktionsflüssigchromatographie (HILIC) und poröse, graphitische Kohlenstoffchromatographie (PGC) als beliebteste Varianten herauskristallisiert haben [3]. Während mittels PGC eine herausragende Trennung von Isomeren zu erreichen ist, erlaubt die HILIC eine besonders robuste und reproduzierbare Routine. Durch die Anwendung spezieller stationärer Phasen und Bedingungen lassen sich viele Trennprobleme in der Glykomanalytik lösen, jedoch besitzen Glykane keine eigenen Chromophore, wodurch der Einsatz von optischen Detektoren wie beispielsweise UV und Fluoreszenz erschwert wird. Um dieses Problem zu umgehen, werden Zucker deshalb in der Regel am reduzierenden Ende derivatisiert. Die Derivatisierung mit optisch-aktiven Labeln wie beispielsweise 2-Aminobenzamid (2-AB) erlaubt nicht nur eine sensitive Detektion, sondern auch eine direkte Quantifizierung der Probe mittels externer Standards.

 
Strukturaufklärung mittels Ionenmobilitätsspektrometrie
Neben den weit verbreiteten LC-Techniken erfreut sich die Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) immer größer werdender Beliebtheit und zeigte kürzlich ihr großes Potenzial für die Trennung sehr ähnlicher Glykanisomere. Sie basiert auf der Trennung von Ionen in einer mit Gas gefüllten Zelle, durch die die Probenmoleküle mithilfe eines elektrischen Feldes geleitet werden (Abb. 1). Auf ihrem Weg durch die Driftzelle kollidieren die Ionen mit dem Puffergas und werden dabei gebremst. Die resultierende mittlere Geschwindigkeit, die sogenannte Driftzeit, ist unter anderem abhängig von der Größe und Form der Ionen, was es in vielen Fällen möglich macht Isomere zu unterscheiden. Darüber hinaus können die erhaltenen Driftzeiten leicht in einen instrumentell unabhängigen Wert, den rotationsgemittelten Kollisionsquerschnitt (collision cross-section, CCS), umgewandelt werden wodurch der Einsatz von Datenbanken möglich wird. Dies erlaubt einerseits die Unterscheidung von Konnektivitäts- und Konfigurationsisomeren von kleineren Oligosacchariden, als auch die Identifizierung von charakteristischen Fragmentionen größerer Glykane oder Glykokonjugate [4].
 
Implementierung von IMS in bestehende LC-MS Abläufe
Während beide Techniken, LC und IMS, in den letzten Jahren ihre individuellen Fähigkeiten zur Auflösung von Glykanisomeren bewiesen haben, wurden nur sehr wenige Versuche unternommen, um beide Methoden zu einem einheitlichen Arbeitsablauf für die Glykananalyse zu vereinen. Insbesondere der Einfluss der Derivatisierung auf das Mobilitätsverhalten isomerer Glykane ist bisher wenig erforscht. Um diese Lücke zu schließen, wurde kürzlich eine Reihe derivatisierter Modellglykane, die sich jeweils nur in einem Strukturmerkmal unterscheiden, systematisch untersucht (Abb. 2). Die Daten zeigen, dass die Ionenmobilitätstrennung stark von der jeweiligen Derivatisierung und von der Art der Adduktionen abhängt. Während es häufig nicht möglich ist, Glykanisomere in ihrer nativen Form zu unterscheiden, können bestimmte Fluoreszenzlabel zu einer deutlich verbesserten Trennung führen. Bemerkenswerterweise liegt der durchschnittliche CCS-Unterschied für die kleineren Trisaccharide bei circa 2%. Bei den Tetrasacchariden ist der CCS-Unterschied mit fast 3% noch größer (Abb. 3). Um zu bewerten, welcher CCS-Unterschied zur Identifizierung von zwei isomeren Spezies in einem Gemisch ausreicht, muss das Auflösungsvermögen des genutzten IM-MS Instruments berücksichtigt werden. Wenn der relative CCS-Unterschied von zwei Ionen 2% beträgt, ist ein Auflösungsvermögen von R = 64 erforderlich, um sie in einer Mischung voneinander zu unterscheiden. Um jedoch eine Basislinientrennung beider Peaks zu erzielen, muss das Auflösungsvermögen jedoch deutlich auf R = 127 erhöht werden. Moderne Instrumente besitzen eine IMS Auflösung von R = 60 bis weit über 200 [5]. Das benötigte Auflösungsvermögen zur Trennung von derivatisierten, komplexen Glykanisomeren wird deshalb fast immer erreicht. Langfristig wird es damit möglich bereits vorhandene LC-MS Arbeitsabläufe durch eine Mobilitätstrennung zu ergänzen [6].
 
Ausblick
Die Kombination von IMS und LC-MS eröffnet völlig neue Perspektiven für zukünftige Glykananalysen. Während LC-Methoden weiterhin zur Vereinfachung der Probenmatrix und Quantifizierung der Probenmenge genutzt werden können, erlaubt die umfangreiche Charakterisierung der Glykane mittels IM-MS eine detaillierte Strukturaufklärung. Durch die Kombination beider Techniken kann so ein detailliertes Bild über die vorliegenden Zucker erhalten werden.

 

Autoren
Christian Manz1 und Kevin Pagel1

Zugehörigkeit
1Institut für Chemie und Biochemie, Fachbereich Organische Chemie, Freie Universität Berlin, Deutschland

 

Kontakt
Prof. Dr. Kevin Pagel

Institut für Chemie und Biochemie
Freie Universität Berlin
Berlin, Deutschland
kevin.pagel@fu-berlin.de
 

Literatur
[1] Varki, A., Biological roles of glycans, Glycobiology 2017, 27 (1), 3-49, 10.1093/glycob/cww086.
[2] Manz, C.; Pagel, K., Glycan analysis by ion mobility-mass spectrometry and gas-phase spectroscopy, Curr. Opin. Chem. Biol. 2018, 42, 16-24, 10.1016/j.cbpa.2017.10.021.
[3] Melmer, M.;  Stangler, T.;  Premstaller, A.; Lindner, W., Comparison of hydrophilic-interaction, reversed-phase and porous graphitic carbon chromatography for glycan analysis, J Chromatogr A 2011, 1218 (1), 118-123, 10.1016/j.chroma.2010.10.122.
[4] Hofmann, J.;  Hahm, H. S.;  Seeberger, P. H.; Pagel, K., Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry, Nature 2015, 526 (7572), 241-244, 10.1038/nature15388.
[5] Dodds, J. N.;  May, J. C.; McLean, J. A., Correlating Resolving Power, Resolution, and Collision Cross Section: Unifying Cross-Platform Assessment of Separation Efficiency in Ion Mobility Spectrometry, Anal. Chem. 2017, 89 (22), 12176-12184, 10.1021/acs.analchem.7b02827.
[6] Manz, C.;  Grabarics, M.;  Hoberg, F.;  Pugini, M.;  Stuckmann, A.;  Struwe, W. B.; Pagel, K., Separation of isomeric glycans by ion mobility spectrometry - the impact of fluorescent labelling, Analyst 2019, 144 (17), 5292-5298, 10.1039/c9an00937j.

 

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