Fluoreszenzproteine „fühlen“ wo sie sind

Fluoreszenz Lebensdauer Imaging mittels Streak-Camera

  • Abb. 1: Messaufbau zum hoch auflösenden FLIM Imaging. (A) gibt einen Überblick über den gesamten Messplatz. Lichtquelle ist ein Titan:Sapphire Laser zur 2-Photonenanregung. Um diese zu optimieren, wird die Pulslänge mittels zwei Prismen komprimiert (B). Zentrales Element im Aufbau ist das Hamamatsu Produkt C9136, welches den Laser-Scan, Descan und die Detektion der Fluoreszenz realisiert. Die Probe selbst befindet sich auf einem inversen Mikroskop. Abb. 1: Messaufbau zum hoch auflösenden FLIM Imaging. (A) gibt einen Überblick über den gesamten Messplatz. Lichtquelle ist ein Titan:Sapphire Laser zur 2-Photonenanregung. Um diese zu optimieren, wird die Pulslänge mittels zwei Prismen komprimiert (B). Zentrales Element im Aufbau ist das Hamamatsu Produkt C9136, welches den Laser-Scan, Descan und die Detektion der Fluoreszenz realisiert. Die Probe selbst befindet sich auf einem inversen Mikroskop.
  • Abb. 1: Messaufbau zum hoch auflösenden FLIM Imaging. (A) gibt einen Überblick über den gesamten Messplatz. Lichtquelle ist ein Titan:Sapphire Laser zur 2-Photonenanregung. Um diese zu optimieren, wird die Pulslänge mittels zwei Prismen komprimiert (B). Zentrales Element im Aufbau ist das Hamamatsu Produkt C9136, welches den Laser-Scan, Descan und die Detektion der Fluoreszenz realisiert. Die Probe selbst befindet sich auf einem inversen Mikroskop.
  • Abb. 2: Schematischer Aufbau einer Streak-Camera. Photonen treffen zu unterschiedlichen Zeiten auf eine Photokathode. Dort werden sie in Elektronen umgewandelt und passieren dann ein elektrisches Feld, welches durch zwei Kondensatorplatten erzeugt wird. Das elektrische Feld ändert sich mit der Zeit, sodass frühe Elektronen wenig und spätere Elektronen stärker abgelenkt werden. So wird die Zeitinformation der Photonen in eine Ortsverteilung übertragen. Ein Phosphorschirm konvertiert die Elektronen wieder in Photonen, die von einer konventionellen CCD-Camera detektiert werden. Das 2D Bild der CCD-Camera enthält nun in der x-Dimension die Ortsauflösung der Probe und in der y-Dimension die Ankunftszeit der Photonen. Um ein vollständiges FLIM-Bild zu erhalten, müssen soviele Streak-Camera Bilder aufgenommen werden, wie das FLIM-Bild Zeilen hat.
  • Abb. 3: 3D-Rekonstruktion einer COS Zelle die zwei Fusionsproteine exprimiert: dsRED mit der Untereinheit VII der Cytochrome C Oxidase zur Visualisierung der Mitochondrien und GFP mit Calretikulin im endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Bilder wurden mit einem Spinning-Disk Konfokalmikroskop erzeugt und und nicht weiter dekonvuliert. Rechts oben ist das Netzwerk des ER dargestellt und rechts unten die Mitochondrien. Im linken Bild wurden beide Strukturen überlagert.
  • Abb. 4: FLIM-Messungen an CFP in verschiedenen Zellorganellen von HEK 293 Zellen. (A) zeigt in jeweils einer Zeile eine Zellorganelle, in der linken Spalte ist zunächst ein Intensitätsbild gezeigt, gefolgt von einem mono-exponentiellen Fit (Lebensdauer und Amplitude) und in der rechten Bildhälfte ist dann ein entsprechender bi-exponentieller Fit zu sehen. Proteinkinase C (PKC) ist ein 70 kDa Protein, das unstimuliert zytosolisch vorliegt. „Zytosol“ markiert Messreihen mit einfachem CFP. Alle anderen Fusionsproteine siehe Legende zu Abbildung 3 oder Text. (B) zeigt schematisch, wie die Ergebnisse in (C) erzielt wurden. Die gestrichelte Linie ist das Absorptionsspektrum, die durchgezogene Linie das Fluoreszenzspektrum. Die rosa Bereiche zeigen die spektrale Lage der Emissionsfilter. In allen Messungen wurde mit 440 nm angeregt. (C) stellt Unterschiede der CFP-Lebensdauern dar, wie sie für verschiedene subzelluläre Lokationen gefunden wurden.
  • Dr. Lars Kaestner, wiss. Mitarbeiter, Universität des Saarlandes
  • Prof. Dr. Peter Lipp, Institutsleiter, Universität des Saarlandes

Fluoreszenzproteine (FPs) haben die Biowissenschaften innerhalb der letzten 20 Jahre revolutioniert [1]. Dieser Entwicklung wurde mit der Verleihung des Nobelpreises für Chemie 2008 an Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien für die Entdeckung und Entwicklung des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) Rechnung getragen. Die Farbpalette der FPs geht inzwischen weit über das GFP hinaus und deckt praktisch den gesamten sichtbaren Bereich bis hinein in den nahen infraroten Spektralbereich ab. Auch wurden unter Verwendung der FPs meist unter Ausnutzung des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) genetisch codierte Biosensoren (GEBs) entwickelt. Diese ermöglichen erstmals die Analyse biochemischer Reaktionen in lebenden Zellen. Allerdings taugen diese GEBs zur Zeit meist noch nicht für quantitative Messungen. Das liegt u. a. an einem noch immer beschränkten Verständnis des molekularen Verhaltens der FPs und GEBs. Eine Möglichkeit molekulare Eigenschaften von FPs in lebenden Zellen zu analysieren ist das Fluoreszenz Lebensdauer Imaging (FLIM).

Für FLIM-Messungen gibt es mehrere technisch grundlegend verschiedene Modi, wie Zeit-korrelierte Einzelphotonenzählung, „gegatete" Detektoren oder Messungen in der Frequenzdomäne [2]. Hier möchten wir eine Methode unter Verwendung einer Streak-Camera, wie sie von der Firma Hamamatsu Photonics angeboten wird, vorstellen. Abbildung 1A zeigt den gesamten Messaufbau und 1B die Kompressionseinheit für den verwendeten Titan:Sapphire Laser.

Die Fluoreszenzlebensdauer oder auch Fluoreszenzabklingzeit gibt Auskunft über molekulare Mechanismen der energetischen Übergänge im angeregten Molekül. Für FPs liegt die Fluoreszenzabklingzeit in der Größenordnung von Nanosekunden, ist aber abhängig von der (Nano)Umgebung des Proteins. Solch kurze Zeiträume lassen sich nicht mit klassischen Imagingverfahren erfassen. Um dieser technischen Herausforderung bei zu kommen wird in einer Streak-Camera durch sehr schnelle Ablenkungsvorgänge (s.u.) die zeitliche Verteilung von Photonen in eine örtliche Verteilung von Photonen umgewandelt, das Ergebnis einer solchen Umwandlung kann dann wie bei „normaler" Bildgebung ausgelesen werden (siehe Abb.

2).

Mit Hilfe von genetisch kodierten Fusionsproteinen sind wir nun in der Lage FPs selektiv in bestimmten Bereichen oder Organellen der Zelle zu exprimieren, beispielsweise führt die Fusion mit der Plextrin homologen Domäne zu einer Plasmamembran-Lokalisierung, während die Fusion mit der Beta-1,4-galactosyltransferase eine selektive Expression im Golgi Apparat bewirkt. Beispiel einer 3D-Rekonstruktion konfokaler Aufnahmen von Organell-spezifischer Expression mit zwei verschieden Fusionsproteinen ist in Abbildung 3 dargestellt.

Verwendung von CFP

Ein besonders wichtiges Fluoreszenzprotein ist das Cyan Fluoreszierende Protein (CFP) und seine Varianten, die sehr häufig als Donatoren in FRET-Konstrukten eingesetzt werden. Für die quantitative Auswertung von FRET-Messungen ist es allerdings essentiell, das spektrale Verhalten wie auch die Fluoreszenzlebensdauer des CFPs zu kennen. Abbildung 4A zeigt exemplarisch FLIM-Bilder einzelner lebender Zellen die CFP-Fusionsproteine Organell- oder Orts-spezifisch exprimieren. Die Messkurven der Fluoreszenzlebensdauer können in der Analysesoftware sowohl mono-exponentiell als auch bi-exponentiell gefittet werden. Die Bild-Korrelate sowohl der Fluoreszenzlebensdauer, als auch der zugehörigen Amplitude sind in Abbildung 4A enthalten. Wie komplex und wenig verstanden die Moleküleigenschaften sind, zeigt sich, wenn man die Fluoreszenzabklingzeit spektral aufgelöst analysiert. Zur Erläuterung ist in Abbildung 4B ein Fluoreszenzspektrum des CFP dargestellt. Die Fluoreszenzlebensdauer wird nun in unabhängigen Experimenten im Bereich 465-495 nm bzw. 510-560 nm gemessen. Die Differenz beider Lebensdauern ist in Abhängigkeit der Lokalisation in Abbildung 4C dargestellt. Unterschiede der Lebensdauern spiegeln Unterschiede der Fusionsproteine (vergl. Proteinkinase C (PKC) und reines CFP im Zytosol) oder der Nanoumgebung wieder. Die FPs können somit ihre Lokalisation „erfühlen". Eine genaue Erklärung der Ergebnisse ist momentan noch nicht vollständig möglich und auch Ansätze dazu würden den Rahmen des vorliegenden Beitrages sprengen. Es sei an dieser Stelle auf weiterführende Literatur [3-5] verwiesen.

Letztendlich müssen Phänomene, wie das in Abbildung 4 beschriebene komplett verstanden sein, um FPs und auf ihnen beruhende GEBs für quantitatives Imaging verwenden zu können. Dieses lässt sich verallgemeinern, denn nicht nur innerhalb einzelner FPs, sondern deren Zusammenspiel in GEBs hält noch viele Fragen offen. Beispielsweise ist noch nicht vollständig geklärt weshalb beispielsweise FRET-Konstrukte mit roten FPs schlecht oder gar nicht funktionieren oder weshalb FRET Effizienzen fast immer deutlich unter den theoretisch zu erwartenden Werten liegen. Um diese Herausforderungen zu meistern ist die intensive Zusammenarbeit von Quantenchemie, Bioinformatik, Molekularbiologie, biophysikalischer Chemie in Kombination mit intelligenten Imaging- und Analysealgorithmen bis hin zu High Content Screens [6] notwendig. Gelingt das, werden der biomedizinischen Forschung in Zukunft Werkzeuge für quantitatives Imaging biochemischer Prozesse (auch mittels FLIM) in lebenden Zellen und in vivo zur Verfügung stehen.

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