Gasphasen-Elektrophorese

Nachweis Virus- und virusähnlicher Partikel

  • Abb. 1: Schematische Darstellung des nES Gemma-Systems.
  • Abb. 2: Überlagerte Spektren zweier VLPs basierend auf CPMV (schwarze Linie) und Bacteriophage P22 (blaue Linie).
  • Abb. 3: Korrelation des oberflächengetrockneten Partikeldurchmessers (EMD) und des Molekulargewichts für Proteine (MW [kDa] = 0,249 × EMD [nm]2,918) [3], intakte Viren (MW [kDa] = 0,031 × EMD [nm]3,672) [4] und VLPs (MW [kDa] = 0,760 × EMD [nm]2,632)[5].

Gasphasen-Elektrophorese unter Verwendung eines nES Gemma-Instruments ermöglicht die Charakterisierung von nativen (Bio-)nanopartikeln. Die Trennung der Partikel erfolgt nach deren oberflächengetrockenen Durchmessern mit anschließender partikelzahlenbasierter Detektion. Die Anwendbarkeit dieses Aufbaus wird im Folgenden für Virus- und virusähnliche Partikel (VLPs) erläutert.

 

Elektrophorese beschreibt die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Vereinfacht gesagt werden Analyten nach ihrer Größe und Ladung aufgetrennt. Schafft man es, die Ladung gleich eins zu setzen, so ist die Größe der Partikel der einzige Parameter, nach welchem die Trennung erfolgt. Transferiert man dieses Prinzip nun in die Gasphase, so erhält man ein Instrument, welches je nach Region als nano Elektrospray Gasphase Electrophoretic Mobility Molecular Analyzer (nES Gemma), als nES Differential Mobility Analyzer (nES DMA), als Macro-IMS (Ion Mobility Spectrometer), Liquiscan ES (Elektrosprayer) oder Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS) bezeichnet wird. Zwar erschwert diese Vielzahl von Bezeichnungen die Suche nach Literaturstellen, jedoch wird in allen Fällen ein Instrument gleicher Bauart beschrieben: Einfach geladene Teilchen eines polydispersen Aerosols werden in der Gasphase bei Umgebungsdruck und unter Verwendung von gefilterter, partikelfreier Raumluft nach ihrem Elektrophoretischen Mobilitätsdurchmesser (EMD) aufgetrennt. Dieser entspricht für sphärische Partikel dem Partikeldurchmesser oberflächengetrockneter Analyten. Durch Variation der angelegten Feldstärke ist es nun möglich, monodisperse Probenfraktionen nach dem Größenanalysator (DMA) zu erhalten. Basierend auf Partikelzahlen, werden diese im Anschluss detektiert. Man erhält ein Spektrum, welches die Größenverteilung von Probenkomponenten im niederen Nanometergrößenbereich bis hin zu einigen hundert nm Partikeldurchmesser wiedergibt. nES Gemma schließt dadurch eine Lücke in der Charakterisierung von Teilchen: Für kleine Moleküle kann diese ausgezeichnet durch Massenspektrometrie erfolgen, für große, homogene Partikel sind Methoden basierend auf Lichtstreuung (wenngleich auch nicht auf Partikelzahlen basierend) eine interessante Alternative.

Workflow der Gasphasen-Elektrophorese

Abbildung 1 zeigt den schematischen Aufbau eines entsprechenden nES Gemma-Systems wie es erstmals 1996 von Kaufman et al.

beschrieben wurde [1]. Eine in einem flüchtigen Elektrolyten (z. B. in einer wässrigen Ammoniumacetatlösung) gelöste Probe wird mit Hilfe einer am Ende konischen Quarzkapillare und einem angelegten elektrischen Feld zerstäubt. Die entstandenen Tröpfchen werden im Gasstrom getrocknet. Zur gleichen Zeit erfolgt die Ladungsreduktion in einer bipolaren Atmosphäre, beispielsweise geschaffen durch einen 210Po a-Teilchen Emitter. Nach Einstellen des Ladungsgleichgewichts werden die einfach geladenen Analytpartikel nun zwischen zwei ringförmigen Elektroden in der Gasphase nach ihrer Größe getrennt. Letztendlich werden die Partikel nach ihrer Separation gezählt. Um dies auch für kleinere Analytmoleküle zu ermöglichen, geht man den Zwischenschritt der Tröpfchenbildung in einer übersättigten Atmosphäre. Erst nach Nukleation werden schließlich die erhaltenen Tröpfchen durch Laserlichtstreuung quantifiziert und zur angelegten Feldstärke, welche für die Separation notwendig war, in Relation gesetzt. Man erhält ein Spektrum wie für zwei VLPs in Abbildung 2 (zwei Spektren überlagert) beispielhaft dargestellt. Die erhaltenen Hauptpeaks entsprechen einfach geladenen Analyten von Cowpea Mosaic Virus (CPMV) basierten VLPs und VLPs basierend auf Bakteriophage P22. Daneben sind auch noch Spuren mehrfach geladener Partikel (Peaks mit geringerem EMD) sowie vorhandene Analytaggregate (Peaks mit höherem EMD) - in beiden Fällen jedoch mit deutlich geringerer Signalintensität - detektierbar.

Der Vorteil von nES Gemma bei der Charakterisierung von VLPs

VLPs basieren auf intakten Viren, bestehen jedoch nur aus einer Proteinhülle. Da kein genomisches Material des Virus mehr enthalten ist, sind diese Partikel nicht mehr infektiös und können somit als Transportvehikel für andere Substanzen oder beispielsweise auch als Impfstoffe eingesetzt werden. Desweiteren ermöglicht das Verkapseln von Genomsequenzen, welche nicht dem Virusgenom entsprechen, die Anwendung dieser Partikel (virale Vektoren), beispielsweise in der Gentherapie (z. B.: Adenoviren oder Lentiviren).

VLPs als Bionanopartikel weisen eine Größe im Bereich von einigen zehn nm Durchmesser auf. Diese Größe prädestiniert diese Analyten für die Analyse mittels Elektrophorese in der Gasphase auf einem nES Gemma-Instrument. Für die Anwendung von VLPs in der pharmazeutischen bzw. biotechnologischen Industrie ist die Charakterisierung dieser Analyten von großer Bedeutung. Gasphasenelektrophorese liefert dabei einen entsprechenden Beitrag: Es kann nicht nur die Größe der Bio-nanopartikel bestimmt werden, sondern auch die Partikelanzahl. Zudem kann die Reinheit von Päparationschargen sowie das Aggregationsverhalten von VLPs untersucht werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, das Molekulargewicht dieser Bionanopartikel aus ihrem EMD abzuleiten. Dies ist insofern von Bedeutung, da klassische Massenspektrometrie hierzu bei weitem nicht immer und wenn dann nur auf entsprechend adaptierten Spezialgeräten in der Lage ist. nES Gemma stellt somit eine kostengünstige Alternative zu nativer ESI-Massenspektrometrie dar.

Wie bereits 2001 [2] gezeigt und 2018 [3] verifiziert, besteht für Proteine ein Zusammenhang zwischen deren EMD und Molekulargewicht. 2015 konnten wir dann einen entsprechenden Zusammenhang für Viren zeigen [4]. Nun gelang es uns, das Portfolio der zur Verfügung stehenden Korrelationen auch auf VLPs auszuweiten [5]. Wie in Figur 3 ersichtlich unterscheiden sich diese Korrelationen – für Proteine, Viren und VLPs – dramatisch, wobei jedoch zu beachten ist, daß aufgrund natürlicher Einschränkungen ein Überlappen der Größen- bzw. Molekulargewichtsbereiche nur marginal gegeben ist.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass nES Gemma eine einfach zu handhabende, kostengünstige und vielversprechende Möglichkeit in der Charakterisierung von VLPs darstellt. Gasphasen-Elektrophorese liefert nicht nur Daten zu Partikelanzahl, Größe und Reinheit von Bionanonpartikelpräparationen sondern ermöglicht auch - unter Verwendung einer geeigneten Korrelation - die Ableitung des Molekulargewichts dieser Analyten.

 

Autoren

Victor U. Weiss1, Samuele Zoratto1, Günter Allmaier1

 

Zugehörigkeit

1Institut für Chemische Technologie und Analytik, TU Wien, Wien, Österreich

 

Literatur

1.         Kaufman, S. L.;  Skogen, J. W.;  Dorman, F. D.;  Zarrin, F.; Lewis, K. C., Macromolecule Analysis Based on Electrophoretic Mobility in Air:  Globular Proteins, Anal Chem 1996, 68 (11), 1895-904, DOI: 10.1021/ac951128f.

2.         Bacher, G.;  Szymanski, W. W.;  Kaufman, S. L.;  Zollner, P.;  Blaas, D.; Allmaier, G., Charge‐reduced nano electrospray ionization combined with differential mobility analysis of peptides, proteins, glycoproteins, noncovalent protein complexes and viruses, J Mass Spectrom 2001, 36 (9), 1038-52, DOI: 10.1002/jms.208.

3.         Weiss, V. U.;  Golesne, M.;  Friedbacher, G.;  Alban, S.;  Szymanski, W. W.;  Marchetti-Deschmann, M.; Allmaier, G., Size and molecular weight determination of polysaccharides by means of nano electrospray gas‐phase electrophoretic mobility molecular analysis (nES GEMMA), Electrophoresis 2018, 39 (9-10), 1142-1150, DOI: 10.1002/elps.201700382.

4.         Weiss, V. U.;  Bereszcazk, J. Z.;  Havlik, M.;  Kallinger, P.;  Gosler, I.;  Kumar, M.;  Blaas, D.;  Marchetti-Deschmann, M.;  Heck, A. J.;  Szymanski, W. W.; Allmaier, G. , Analysis of a Common Cold Virus and Its Subviral Particles by Gas-Phase Electrophoretic Mobility Molecular Analysis and Native Mass Spectrometry, Anal Chem 2015, 87 (17), 8709-17, DOI: 10.1021/acs.analchem.5b01450.

5.         Weiss, V. U.;  Pogan, R.;  Zoratto, S.;  Bond, K. M.;  Boulanger, P.;  Jarrold, M. F.;  Lyktey, N.;  Pahl, D.;  Puffler, N.;  Schelhaas, M.;  Selivanovitch, E.;  Uetrecht, C.; Allmaier, G., Virus-like particle size and molecular weight/mass determination applying gas-phase electrophoresis (native nES GEMMA), Anal Bioanal Chem 2019, 411 (23), 5951-5962, DOI: 10.1007/s00216-019-01998-6.

 

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Technische Universität Wien


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